嗜热栖热菌木糖异构酶结构和功能关系及其改造的研究.pdf

摘 要 I。一 ————J篡一嘲嬲 近年来，随着对可再生资源的利用及发展循环经济的迫切需要，利用木糖异构酶 构建发酵半纤维素水解产物木糖生产乙醇的重组菌成为研究热点。由于嗜热木糖异构 酶在酿酒酵母中表达出活性，并参与了酿酒酵母木糖代谢途径的构建，故而深入了解 其独特的结构机理并通过酶分子改造提高其活性，对构建新型高效利用木糖生产乙醇 的重组酿酒酵母菌具有重要的理论及应用意义。 本论文对木糖异构酶的基本性质、序列及结构特点、催化机理、热稳定性机理以 及蛋白质理性设计的方法等进行了较全面的论述。针对嗜热木糖异构酶结构的复杂性 及其在低温下活性极低等问题，以嗜热栖热菌木糖异构酶 (砌溯淞肪绷印办抛 xylose 研究了该酶结构与功能的关系。 运用基因工程技术，从Z珈硎印办玎螂中获得了具有N9lD突变的嗜热木糖异构 酶(Ttl：lXI-N91D)基因，在E oC，最适 T廿ⅨI．N91D酶学性质进行了研究。结果表明，TthXI．N91D最适温度为80 mmol·L～， oC下半衰期为225min。在60 7．5下该酶的％，为15．20 pH为8．0，80 oC，pH s_1 ‰甜为69．54 k√^乙为3．33 Umol·min‘1，惫咖为50．62 底物特异性实验表明该酶可专一催化木糖。根据TthxI-N91D专一催化底物木糖的特 1．5 性，建立了一种利用该酶检测溶液中木糖含量的新方法。该方法所需TtⅨ1-N91D min， U，山梨醇脱氢酶O．08U，辅酶NADH终浓度为0．25mmol·L一，检测过程仅需20 检测木糖的线性范围在2．5．12．5眦ol·L以之间。检测方法的标准偏差为 验结果表明该方法在多种糖混合溶液中可以特异性的检测出木糖的浓度，回收率为 93．1％．102．2％。该方法简便，耗时短，可以同时检测多个样品，结果较为稳定可靠。 该方法已经成功应用于本实验室酿酒酵母发酵过程中木糖消耗的检测。 ● 为了更好地阐明Tt腻I．N91D酶学性质的结构机理，首先运用分子对接软件，构建 nm、0．207衄、0．202 和D286等羧基氧原子与M91之间的距离分别为O．204 nm和0．206 摘要 定了底物在活性中心的构象。在上述模型基础上运用WHATm5．0软件进行了N91D突 变酶的同源建模，突变前后活性中心的构象比较分析表明N91D突变导致残基H53原子 NE2与底物木糖05原子之间的距离比突变前下降了0．083nIIl，有利于底物开环过程中H 原子的传递；残基T89OGl与木糖C5之间的距离由突变前的O．51911IIl下降为突变后的 O．386姗，不利于容纳与稳定葡萄糖06有关的水分子及体积更大的葡萄糖底物，可能 是其易于结合底物木糖及催化专一性增加的主要原因。其次，为了更好地了解嗜热木 糖异构酶在高温下活性增加的结构动态行为，运用分子动力学模拟的方法探讨了不同 温度对TthXI复合物结构柔性的影响。模拟结果显示，在300K和360K，残基片段60．69、 142．148、169．172和334．340的B．因子都较高显示出较大的柔性。与300K相比，在360 KB．因子上升O．06眦的残基主要分为两组：一组涵盖了残基55．80组成的 K亚基界面比300 四聚体亚基界面相互作用进行了分析比较，发现