犬2型腺病毒云南强毒株的分离鉴定.pdfVIP

犬2型腺病毒云南强毒株的分离鉴定 范泉水郑颖邱薇 张富强李刚山李作生王双印冯子良 周卫国覃敏叶封平 (成都军区疾病预防控剁中心昆明650118) 摘要我们在进行犬腺病毒分子流行病学调查过程中。应用MDCK细胞从云南送检 的犬粪便中分离出l株犬腺病毒样粒子(命名为SY株)，并对其进行了系统鉴定。分离的 病毒在MDCK细胞上能引起葡萄串样典型的细胞病变：用培养物上清作电镜负染观察， 见有呈20面体立体对称，大小约80nm，表面具有排列整齐壳粒的腺病毒样粒子；取其细 胞成分作电镜超微结构观察可见其细胞核中有呈晶格状排列的腺病毒样粒子前体：理化特 性鉴定表明SY株能抵抗乙醚、酸(pH 所抑制；对犬、猪原代与传代肾细胞敏感，对其它细胞不敏感；SY株能凝集大鼠和人“O一 型红细胞而不凝集豚鼠的红细胞；交叉中和试验结果表明，SY与标准CAV-2的豚鼠免疫 =28％70％)；用分离的病毒对易感犬进行人工感染，接种的犬出现发烧、咳漱、鼻炎、 腹泻等CAV-2感染的典型的临床症状和病理解剖变化；SY毒株的病毒核酸与用船p标记 的CAy特异核酸探针杂交结果与参考的标准病毒一样，呈阳性杂交信号：应用CAr特异引 物，进行SY的DNA 核酸电泳带。通过以上的形态学、理化学、血清学、动物感染试验与分子生物学鉴定，证 明我们所分离的SY株为1株CA卜2病毒强毒株。 关健词犬传染性喉气管炎病毒，犬2型腺病毒； 分离鉴定 犬腺病毒(canine 中分离获得的，主要感染小狗导致传染性喉气管炎(小狗咳嗽)，也有咽炎、坏死性支气 在呼吸道上皮复制外，病毒也能在消化道上皮中增殖导致狗发生腹泻。CAV-2在毒力、可 溶性抗原结构、细胞感染范围以及红细胞凝集范围方面都与标准株犬传染性肝炎病毒有些 差别。但是应用CAV-2免疫的犬，却可有效地产生对强毒犬传染性肝炎病毒的免疫力。1984 年，夏咸柱等在我国首次分离到犬传染性肝炎病毒，证实了我国犬中也有犬腺病毒1型的 感染III。1989年，钟志宏等从患脑炎的狐狸中分离到了犬腺病毒l型，即狐狸脑炎病毒滞I。 1lO 随后，哈尔滨、北京、上海、昆明等地相继分离获得病毒19I。犬腺病毒2型的分离尚末见 公开报道，因为在肠炎犬的粪便样品中有时也可以发现CAV样病毒粒子，以及从临床报 告及犬肠源性腺病毒研究来看，犬腺病毒2型野毒株感染在我国也比较普遍。我们在开展 的CAV分子流行病学调畲研究中，从云南一条昆明犬肠炎粪便中分离获得1株CAV，经 系统鉴定证明为1株CAV-2强毒(暂定名为SY株)，现报告如下： 1．材料与方法 1．1病毒分离 1．1．1样品与处理 病料来自云南一患肠炎而死亡的昆明犬，采集肠炎犬粪便，用Hanks液制成I：10的 H微孔滤膜过滤后，置-30C冰柜待分离。 乳剂，经50009离心沉淀10min取上清，经O．22 1．1．2细胞与培养 所用MDCK细胞从中国兽药监察所引进，按常规消化传代，37C静置培养。 1．1．3分离与判定 待MDCK长成单层后，弃生长液，按培养液量体积的1／10接入待分离的样品，37℃ 吸附30min后，加维持液继续于37C静置培养4．5天，每天观察有无葡萄串样细胞病变． 如无病变则于培养的第4．5天收取上清，细胞继续按常规传代培养，至第5代仍无病变视 为分离阴性，出现细胞病变的经．30℃／37℃冻融3次收毒，置于-30℃待用。 1．2常规病毒学鉴定 1．2．1参考病毒与参考血清 效价为IXl0孔SrciDs 病毒的SN效价分别为l：256和l：512。 1．2．2形态学观察 用SY第5代MDCK培养物(SY-5)单层接种MDCK2瓶，37C静置培养待出现典 取上清以o．5％磷钨酸负染作电镜观察；另一瓶收上清，细胞用无菌细胞刮子刮下，以戊 二醛与锇酸双固定，F812环氧树酯包埋、切片，染色作电镜超微结构观察。 1．2．3病毒理化学特性试验 取SY-5 放4℃过夜后，无菌挥发除去全部乙醚；第3瓶先用0．1 moi／L 作用2小时后用0．1 毫升50微克，于4℃作用12小时；第5瓶不处理作为正常对照。然后分别用MDCK测定 这5瓶SY-5的TCID。o。 1．2．4细胞敏感谱试验 感染指标，计算各细胞培养物的TCID；o。 1．2．5红细胞血凝谱试验 采用微量血凝法，分别以O．5％