第三章基因工程设计策略及操作流程2要点.pptVIP

3 基因工程设计策略及操作流程 3.4.1 基因的体外连接重组 含目的基因的外源DNA在体外通过限制性内切酶和DNA连接酶的作用与载体连接，获得重组DNA的过程，称为基因的体外连接重组。 基因的体外重组有两种方式：插入式和置换式。 插入式是用一种限制性内切酶消化载体，在载体上此酶只有一个识别序列，实现外源片段插入载体的切口； 置换式可用两种限制性内切酶或是在载体上有两个识别序列的一种限制性内切酶处理载体，载体被切成大小不等的两个片段，把外源DNA与载体大片段连接，即置换了载体中原有的小片段，形成重组DNA分子。 形成重组DNA的实质就是催化外源DNA与载体DNA间高效地形成3′,5′-磷酸二酯键，连接方式有很多种，具体使用时要根据外源DNA与载体DNA末端的性质选择合适的方法，以保证连接效率。 （1）互补黏性末端的连接 互补黏性末端的产生是由于外源DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割或是用两种同尾酶切割，但用同尾酶切割后产生的重组DNA分子丧失了原有的两种限制性内切酶的识别序列。 20 μL的互补黏性末端连接反应体系为： 2 μL T4 DNA连接酶缓冲液或E. coli DNA连接酶缓冲液 5 μL外源DNA片段 5 μL载体DNA片段 1 μL T4 DNA连接酶或E. coli DNA连接酶 其它用ddH2O补齐 充分混匀后，