环糊精葡基转移酶的基因分析、诱导表达及分离纯化的研究.pdfVIP

环糊精葡基转移酶的基因分析、诱导表达及分离纯化的研究 摘要 环糊精葡基转移酶(cGTase)是一种重要的工业用酶，用来 生产环糊精和寡糖，该酶基因已经可以从30多种细菌中分离，其 中几种已经得到鉴定，生化性质也得以验证。为更好地研究环糊 精葡基转移酶的作用机制和功能，在基因水平和蛋白水平上针对 该酶的结构和不同CGTase亚种的相似性也进行了分析研究。 本文对来源于嗜碱性芽孢杆菌N一227菌株染色体上一段编码 B一环糊精葡基转移酶基因进行克隆分析、诱导表达并转化到大肠杆 菌中，发酵得到CGTase的较高酶活力，分离纯化得到纯的蛋白酶。 对包含有自己的启动子且能够直接在大肠杆菌中表达 碱基，从745位点到2883位点包含2139个碱基，为一个推定的 circulans 编码713个氨基酸的蛋白质阅读框，和来源于Bacillus A11的B。环糊精葡基转移酶氨基酸完全一致；具有环糊精葡基转 移酶典型的五个结构域A。E，在A—B结构域中包含有七个属于a一 淀粉酶家族的保守区域(I—vii)。对该酶基因进行PCR并克隆到表 达载体pET28b上，利用乳糖进行诱导，获得了高效表达，这对于 B，环糊精葡基转移酶的应用和降低成本具有重要的价值。 为提高酶活力，研究了不同添加物质及其浓度对菌株产酶的影响。 表达B．环糊精葡萄糖基转移酶的工程茵E．coliBL21(DE3)在含有不 同浓度葡萄糖的LB培养基中进行发酵时，O．2％的葡萄糖浓度使酶活 mmol／L 提高2．7倍，经0．75％的乳糖诱导时的表达量与1 IPTG诱导时 相当。选择卡那霉素(Kan)、乳糖、Triton．X、甘氨酸的终浓度这四 个因素，分别考察三个水平，由L9正交试验确定影响产酶活性的各因 素的最佳浓度，即Kan 0．5％、甘氨 1099／mL、乳糖O．75％、Triton-X 酸1．0％，以此条件发酵E．coli U／mL，达到初始值的5．2倍左右。 中测得的酶活值为247．4 B一环糊精葡基转移酶的粗酶液经过淀粉一酒精沉淀或淀粉一硫酸 S．100凝胶层析后，比活力分别提 铵沉淀初步纯化，然后经Sephaeryl 高了16倍、2l倍、50倍，由初始11．44 U／mg U／mg蛋白质增加到572．67 示为单一的蛋白带，酶的分子量为70kDa。酶学性质研究表明该酶的 以下保温30min基本保持稳定；利用酚酞分光光度法测得的纯酶液的 U／mL；以可溶性淀粉为反应底物时，动力学参数为 环化活性为13．85 0．72 mg／mL，表明该酶对可溶性淀粉具有较强的亲和性。 关键词：p．环糊精葡基转移酶，基因分析，诱导表达，纯化，性质 Ⅱ on Research and Sequence Analysis，InducedExpression Purificationof Glucanotransferase Cyclodextrin Abstract Cyclodextrin all industrial glucanotransferase(CGTase)isimportant enzyme whic