用于提高马铃薯淀粉含量的glgC基因克隆、突变及表达载体构建.pdfVIP

摘 要 日常生活和国民经济中起着举足轻重的作用。马铃薯淀粉由于其优良的加工性 能，应用范围极其广泛，而且在某些应用领域是其它来源的淀粉所无法替代的。 在西部大开发的历史机遇下，马铃薯生产和加工将成为西部农村经济的支柱产业 但现有的主栽马铃薯品种淀粉含量一般在13～18％，仅有少数品种可达到20％ 左右。为适应马铃薯加工产业的迅速发展，选育适合甘肃栽培的高淀粉含量马铃 薯加工型品种的工作迫在眉睫。由于高淀粉含量的马铃薯育种材料极其匮乏，加 之马铃薯又是同源四倍体，遗传分离复杂，故运用常规育种方法培育高淀粉含量 的马铃薯品种不仅耗时耗能且难度极大。基因工程技术则可以打破物种间的界 限，使得不同生物来源的基因在受体植株的特定时空表达，近年来随着人们对淀 粉生物合成途径及其相关酶的进一步深入研究及分子生物技术的R趋成熟，使得 运用基因工程技术调控淀粉合成中相关酶的活性从而提高马铃薯块茎淀粉含量 成为可能。 本研究从马铃薯组培苗(台湾红皮)叶片中提取基因组DNA，设计PCR扩增 I Patatin的功能区段， 特异引物，克隆到马铃薯块茎特异性表达启动子Class DH5 vector连接，转化￡coJi 将其与pUCm-Teasy a，得到重组子pUCmP；经 酶切和序列分析鉴定，该片段分子大小为1030bp，通过序列对比分析发现与已报 I box与CAATbox调控 道的CiassPatatin碱基序列有94％的同源性，含有TATA 元件，分别位于转录起始点上游一21～一13bp与一59～一48bp：CAATbox上游有核 心增强子(core 因组DNA，设计特异扩增引物，采用PCR扩增技术克隆到大肠杆菌腺苷二磷酸葡 DH5 vector连接，转化叵coli 萄糖焦磷酸化酶(glffC)基因，将其与pUCm—Teasy 码432个氨基酸残基，通过序列分析与文献报道的碱基序列有99％的同源性。考 虑到变构调节因子对腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的调控作用，设计突变引 核苷酸由G到A的定点突变，即使第336位氨基酸由甘氨酸变为天门冬氨酸，以 降低该酶对激活因子果糖一6一磷酸(F6P)的依赖性和对抑制因子腺苷一1一磷 酸(AMP)的敏感性，得到正确的突变基因glgC336及其转化子pUCmGT。 28a—C(+)的T7 然后将glgC和glgC336基因分别插入到微生物表达载体pET 启动子和终止子之间，构建成N一端携带6XHiS标签子的原核表达载体，通过IPT6 诱导表达，提取表达产物，进行SDS—PAGE电泳鉴定，都得到分子质量约53×103 的分子质量相符。 进一步做转化和选育高淀粉马铃薯品种奠定了基础。 关键词：马铃薯 淀粉 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 块茎特异表达启动子 基因克隆 突变 原核表达 植物表达载体构建 Abstract the callbeusedas tuberosum that and Potato(SolariumL．)is only grain crop vegetables in theworld．It role l