基因工程酶与载体要点.docx

生物技术 2011051838 即使往人类的知识宝库里投入一颗沙子也是伟大的——居里夫人 《基因工程原理》作业 1.同裂酶和同尾酶有何区别？ 同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。 同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。 不同的地方：同裂酶识别相同的核苷酸序列，可能切割产生不同的末端；同尾酶识别不相同得核苷酸序列但产生的末端相同。 2.基因工程常用的各种酶的催化活性与用途。 表1 基因工程常用的工具酶 核酸水解酶核酸合成酶核酸修饰酶其它分子克隆工具酶核糖核酸酶DNA聚合酶甲基化酶依赖于DNA的RNA聚合酶脱氧核糖核酸酶RNA聚合酶激酶连接酶限制性核酸外切酶连接酶 基因转移酶T4多核苷酸激酶限制性核酸内切酶磷酸酶碱性磷酸酶 核酸酶核酸酶抑制剂琼脂糖酶DNA结合蛋白 其他酶  表2 基因工程各种工具酶活性及用途 工具酶名称活性及用途甲基化酶生原核物甲基化酶将 DNA 甲基化后，就不被相应的限制酶所切割。Dam 甲基化酶在a处甲基化。 E.coli DNA聚合酶I5’→3’外切酶活性（DNA复制）； 3’→5’和5’→3’外切酶活性（较正和切除）。 Klenow DNA 聚合酶DNA聚合酶I经蛋白酶裂解而从全酶中除去具5’→3’外切酶活性得到的肽段。T4 噬菌体DNA聚合酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌； 5’→3’聚合酶活性，效率为pol I的两倍； 3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA。  T7 噬菌体 DNA 聚合酶来源于T7 噬菌体 感染的大肠； 5′→3′DNA聚合酶活性和外切核酸酶活性； 3′→5′外切核酸酶活性为klenow酶的1000倍。 Sequenase（测序酶）切除了 99% 以上的 3‘--5’ 外切活性的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶； Sequenase Version 2 切除了所有的 3--5 外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。  耐热 DNA 聚合酶分离自水生栖热菌，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性； 主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍。 反转录酶依赖于RNA的DNA聚合酶，来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）。 末端转移酶 （terminal transferase）一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3羟基端； 用于催化DNA的3末端添加同聚物、DNA的3末端标记等。 连接酶 （Ligase）连接酶就是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。 T4 多聚核苷酸激酶 （polynucleotide kinase）多核苷酸激酶是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初也是从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的，因此又叫做T4多核苷酸激酶。  碱性磷酸酶催化除去DNA或RNA 5’-磷酸的反应； 2通过去除5’-磷酸基团，可以防止DNA片段自首连接，或标记5’端前除去DNA或RNA的5’磷酸。 核酸酶核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。 核酸酶抑制剂抑制的RNase； 用途：cDNA合成反应中，如反转录，RT-PCR，体外转录和体外翻译 。 琼脂糖酶琼脂糖水解酶，将琼脂糖亚单位水解呈新琼脂寡糖。对热很稳定，反应不需缓冲液； 用于从低熔点琼脂糖凝胶中分离纯化大片段DNA或RNA片段。  单链DNA结合蛋白SSB 协同的和单链DNA结合而不与dsDNA结合，维持单链DNA的稳定。 拓扑异构酶是指通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键，然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶。 RecA蛋白 可促进dsDNA对同源ssDNA的吸收作用，是依赖于DNA的ATP酶。蛋白酶K常用的蛋白酶，用于去除残留的酶类及样品中的蛋白质。溶菌酶是一类水解细菌细胞壁中肽聚糖的酶。分子克隆中常用的是卵清溶菌酶，用于破碎细胞。 解旋酶*在DNA或RNA复制过程中催化双链DNA或RNA解旋的酶光解酶*在DNA的修复中起作用，由于DNA序列中TT在光照下容易形成嘧啶二聚体，加入光解酶后就可以避免形成二聚体。 颗粒酶B*是杀伤性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的颗粒中最重要的丝氨酸蛋白酶，引起的细胞凋亡。 基质金属蛋白酶*水解细胞外基质的蛋白裂解酶，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。 ＴＡ