推荐二零一六年度宁波市科技进步奖励项目情况公示表（基础研究.docVIP

推荐2015年度宁波市科技进步奖励项目情况公示表（基础研究类） 推荐单位 浙江大学宁波理工学院 项目简介： 生物催化技术作为新一代物质加工模式，具有催化效率高、选择性强、反应条件温和、环境友好等优势，已成为化学工业绿色制造不可或缺的重要工具。酶是生物催化的核心要素，采用合适的方法对酶的分子结构进行恰当的修饰或改造，使其催化选择性、催化活力、稳定性等关键性质满足实际应用的需要，一直是该研究的核心内容。本项目以探索酶分子高效改造的理论和方法为研究目的，选用两种具有重要应用价值的酶：细胞色素P450 BM-3和谷氨酸脱羧酶（GAD）作为研究对象，运用定向进化技术对其进行改造和设计，通过酶学性质表征、同源建模、分子动力学模拟等技术探讨了突变位点与酶结构、酶催化活性及其稳定性之间的内在关系，加深了对P450 BM-3和GAD结构-功能关系的理解，推动了酶工程研究理论的发展。其创新点和主要技术指标为： （1）在酶分子改造中引入同源建模、分子模拟、分子对接和虚拟筛选等生物信息学研究手段，建立了定向进化、半理性设计和理性设计等多种方法相结合的酶分子协同改造方案，显著提高了酶分子改造的效果和效率，完善了酶分子改造理论，丰富了酶分子改造方法； （2）采用酶分子的协同改造方案，显著提高了P450 BM-3催化吲哚生成靛蓝的催化效率（最提高了11倍），得到了一系列催化性能优良的突变酶，并通过将P450 BM-3与葡萄糖脱氢酶进行串联表达，在催化体系中引入了辅酶NADPH的再生途径，解决了NADPH不足对P450 BM-3催化活性的限制； （3）采用半理性设计方法，改变了P450 BM-3催化吲哚羟基化的产物选择性和产物组成，获得了一个产物为红色、以靛玉红为主产物（含量＞90％）的突变酶D168W，并阐明了催化产物组成改变的分子机理； （4）采用理性设计方法，构建了C末端缺失的GAD突变体GADΔC，解除了C末端氨基酸序列对活性口袋的“封闭”效应，提高了GAD在中性pH值条件下的催化活力，并阐明了短乳杆菌重组GAD的C末端影响酶最适pH的分子机理； （5）采用理性设计与定向进化相结合的方法，提高了GAD的热稳定性和催化活力，并识别出对维持 GAD 的正确结构及催化特性有重要的影响氨基酸残基位点Q51、 D88、S307、K413以及 N-末端区域，加深了对GAD结构－功能关系的理解。 本研究获得授权中国发明专利8项，发表学术论文20 篇（其中SCI/EI论文17 篇），Chemical Reviews、Angewandte Chemie-International Edition、PNAS、Critical Reviews in BiotechnologyCurrent Opinion in Chemical Biology、Current Opinion in Microbiology、Biotechnology and Bioengineering等顶级及TOP期刊论文，了同行的积极评价成果为酶分子的改造提供了有益的理论指导和方法借鉴，产生了的学术影响。 1 浙江大学宁波理工学院 2 浙江大学 3 浙江科技学院 排序 主要完成人 工作单位 技术职称 对本项目技术创造性贡献、 曾获国家、省科技奖励情况 1 梅乐和 浙江大学宁波理工学院 教授 作为第一完成人，参加项目全过程，总体负责项目规划、研究计划和方案制定，提出实验方法及协调组织等，提出了酶的协同改造思路和技术方案，参与了本项目的全部技术内容，包括蛋白质定向进化技术平台的建立，P450 BM-3的表达和定向进化研究，P450 BM-3的半理性改造和理性设计以及GAD的协同改造研究工作，对该项目《主要技术创新点》栏中所列第1、第2和第3项创新做出了创造性贡献，是所有代表性论文和发明专利的完成人，在研发工作中投入的工作量占本人工作总量的70％。 曾获省部科技奖2项 2 胡升 浙江大学宁波理工学院 讲师 作为重要骨干参与项目的具体实施，采用半理性设计改变了P450 BM-3催化吲哚羟基化的产物组成，得到了以靛玉红为主要产物的突变酶，首先提出了pH值调控GAD活性的机理假说和改造酶pH值调控性质的研究方案，对本项目《主要技术创新点》栏中所列第2项和第3项创新做出了创造性贡献，是发明专利ZL 200810061399.9、ZL 200810061398.4、ZL 201010268769.3、ZL 201010268770.6、ZL 201210431917.8和代表性论文（附件4）中论文4～7的完成人；此外，还参与了P450 BM-3的其他改造研究，是授权发明专利ZL 201210257003.4、20120725133846、ZL 201210256836.9和其他论文（附