电子显微镜免疫组织化学技术.ppt

第七章 免疫电镜 一 电镜免疫组织化学技术概述 特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。 （一）组织固定与取材 原则： 既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。 固定： 固定剂的要求： ①不损害细胞内抗原的活性； ②固定速度快、效果好； ③分子量小，易于渗透； ④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。 影响固定的因素有： ① 固定剂的种类； ② 固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差； ③ 固定剂的pH； ④ 固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞自溶作用和水分抽提； ⑤ 固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致； ⑥ 与被固定的细胞类型有关。 选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。 多聚甲醛—戊二醛混合液 过碘酸—赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液)： 对含糖类丰富的组织固定效果特佳。 （使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件。） （二）免疫染色 包埋前染色 包埋后染色 超薄切片免疫染色 1 包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。 特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋： 即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。 包埋前染色的组织，以中层较为理想。 表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。 半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（PAP），免疫反应部位呈黑点状； HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。 取相连续的超薄切片 为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。 2 包埋后染色（载网染色） 组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片； 免疫组化染色（载网染色） 注意事项： ① 四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。 优点： 超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性， 还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。 缺点： 抗原活性在样品处理过程中可能减弱甚至丧失； 环氧树脂中可与组织成份发生反应而改变抗原性质； 包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。 3 超薄冰冻切片 将组织置于蔗糖保护液中，以液氮速冻； 在冰冻超薄切片机上切片； 免疫染色。 不需经固定、脱水、包埋等步骤，所以抗原性保存 较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。但技术条 件要求较高、难度较大。 （三）包埋 树脂包埋、低温包埋 2 低温包埋 1）包埋剂的配制： 由三个部分组成：单体，交联剂和引发剂。 调整单体、交联剂比例，增加交联剂，可增加组织块的硬度。 中等硬度的组织块，其配制比例如下： K4M：单 体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g 可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用 玻棒轻搅3—5 min或用一小管通入液氮气泡搅拌。勿过分搅拌， 以防氧的气泡进入包埋剂中。 2) 生物样品处理程序 ① 取材，以多聚甲醛一赖氨酸—过碘酸钠固定； ② 含7％蔗糖PBS，冲洗过夜； ③ 0.1 mol／LPBS， pH 7.2冲洗； ④ 系列脱水； 3) 免疫染色 ① 切片贴在金网或覆有碳膜的镍网上； ② 正常羊血清30 min； ③ 稀释一抗，37℃2h； ④ 可用烧杯法(或塑料壶喷洗法)，以镊夹镍网在烧杯中洗荡； ⑤ 正常羊血清30min。 （2）LR white和LR gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂； 具有极低粘度和较强嗜水性，穿透性强，有利于抗体(或抗原) 和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位； 在免疫细胞化学的光镜(半薄切