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乳酸菌菌种的分离筛选方法
乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌,杆状或球状,革兰氏阳性菌,无芽孢,不运动。营养要求高,需要提供丰富的肽类 氨基酸 维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。
通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。
乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类
时,SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基,链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。
嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为:杆菌,两端圆,不运动,无
鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性,圆形或椭圆形。
乳酸片球菌细胞呈球状,直径0.6~1.0μm,在直角两个平面交替形成四联状,一般细胞成对生,单生者罕见,不成链状排列。革兰氏阳性,不运动,兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小,呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。
乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落,不易观察,所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质,也常常加入醋酸盐,因醋酸盐能抑制部分细菌生长,对乳酸菌无害。
培养基中添加碳酸钙,乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈,作为分离鉴别的依据,通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。
乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸,维生素及微氧,一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿 酵母膏 油酸 吐温等物质,均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长,对乳酸菌无害。
一.筛选方法:
1.溶钙圈法:
利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈,从而筛选出这些产酸类细菌,可用于乳酸菌的筛选。
其中培养基中加入CaCO3的作用是:①鉴别能产生酸的细菌;②中和产生的酸,以维持培养基的PH。
筛选过程:样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色,经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。
2.溴甲酚绿指示剂法:
培养基:MRS培养基(含溴甲酚绿酒精溶液)
筛选过程:同上,不同之处是稀释涂布后长出菌落,挑取使溴甲酚绿变色的菌落。
二.菌种的分离筛选
1.培养基:
★1.1麦芽汁碳酸钙培养基:麦芽汁(10BX)1L 预先灭菌碳酸钙5-10g/L PH自然 (分离用)
★★1.2牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L 葡萄糖 10g/L 吐温0.05% CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01% PH6.0-6.5(分离用)
★1.3番茄汁碳酸钙培养基:
酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5 (分离用)
1.4葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/L PH 6.0-6.5
1.5蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0g/L
MgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO4 0.2-0.25g/L NaAC 3.0-5.0g/L PH 5.5-6.5
1.6蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆0.5- 1.0g/L
KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO4 0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L
PH5.5-6.5 (发酵或种子培养基)
★★1.7 MRS培养基 (分离培养计数用)
蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、 酵母膏 5.0g、 柠檬酸氢二铵 2.0g、
葡萄糖 20.0g、 吐温 80 1.0mL、 乙酸钠 5.0g、 磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁 0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、 蒸馏水1L, pH 6.5。(分离培养基),当MRS培养基冷却至45~50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。
1.8 BCP培养基(溴甲酚紫培养基)
乳糖5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g 0.5℅溴甲酚紫10ml 自来水1000ml pH6.5-7.0 (分离用)
1.9 BCG牛乳营养琼脂:脱脂奶粉
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