第六七植物原生质体培养和细胞融合.ppt

植物原生质体培养和细胞融合 原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球  原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast) 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。 核质体(nuclearplast) 由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。 胞质体(cytoplast) 不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。 植物细胞育种中的核质替换 细胞质杂种的获得 远缘杂交创造新物种细胞 细胞器的互作研究 用于分离原生质体的材料 机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。 酶解法的优缺点 优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。 沉 降 法 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 优缺点： 纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，常引起原生质体的破碎。 又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。 优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。 原 生 质 体 鉴 定 低渗爆破法 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%) 原 生 质 体 活 力 测 定 形态识别 形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。 原 生 质 体 活 力 测 定 荧光显微镜识别(FDA法) FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。 原 生 质 体 活 力 测 定 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 影响原生质体数量和活力的因素 供试材料及预处理方法 酶解条件： 酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 分离条件： 离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。 分离用具 酶的种类、组合、浓度 pH 分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。 如制备菜豆叶片原生质体时： 低pH（4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，被破坏的细胞较多; pH值偏高（7.0） ，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。 光照和温度 制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间内保持一定的温度，原生质体方能释放。 脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质体一般是在黑暗条件下进行的。 在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离 。 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。 渗透压稳定剂 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而破坏内部结构。 常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，浓度约在0.40M~0.80M。渗透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂 。 质膜稳定剂 目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。 常用的质膜稳定剂 葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾。 固体薄层培养法 优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟