第六原生质体培养和体细胞杂交.pptx

第六章 原生质体培养和体细胞杂交;三个问题;什么是植物原生质体？;原生质体;第一节 原生质体的分离与纯化;二、材料的预处理 (1)暗处理 在分离原生质体前,将在温室内生长5-7周的豌豆枝条取下后,置于维持一定湿度的暗室中预培养1-2天。获得的原生质体存活率较高,并能继续分裂。 (2)预培养 把羽衣甘蓝叶撕去下表皮，置于又到愈伤组织的培养基上预培养7天，然后再用酶液脱壁。 得到的原生质体量虽低于未经处理的对照组，但培养时分裂频率提高，并很快形成能生根的愈伤组织;(3)预萎蔫 将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片稍萎蔫，则有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁分离原生质体。 (4)预质壁分离 把材料先放到与酶溶液中糖浓度相同的糖溶液中预培养1h左右，是细胞质壁分离，然后再放入酶液去壁。加快原生质体的释放，提高原生质体的活力。 ;三、分离方法;（二）酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。;酶解分离法 优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质会影响所获原生质体的活力 ;酶解分离法;酶液的配制;常用的渗透稳定剂;（3）分离原生质体;分离需注意： 材料和酶液的体积比： 1:10 温度：25-30℃ 黑暗或弱光条件 一般静置进行，每隔一段时间轻轻摇动几下，也可将培养皿一直放在50r/min的摇床上轻轻振荡来分离原生质体 ;（4）原生质体的纯化;①离心沉淀法（沉降法） 步骤： 将收集的含有原生质体和酶液的滤液低速离心 经离心后，原生质体沉降与管底，上部为含碎片的混合液。弃去含杂质的上悬液，重新悬浮原生质体，再次离心，如此重复3次 用原生质体培养基洗涤一次，收集管底纯净的原生质体，用培养基调整到一定密度后进行培养 优点：操作简便 缺点：在制备过程中易造成原生质体的损伤，而且纯度不够好???常存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体 ;②漂浮法 滤液 原生质体漂浮于溶液表面，杂 质下沉到管底 反复 离心和重新悬浮2-3次，最后用原生质体培 养基洗涤1次后调整到所需密度进行培养。 ;③界面法 原理：高分子聚合物混合液产生两相水溶液，通过离心可使原生质体处于两液相的界面之间 优点：可获得数量较大的纯净原生质体，同时避免了在收集过程中原生质体因相互挤压而破碎 ; 加培养基使原生质体密度为104－106/mL;（5）原生质体活力的测定;②染色法 荧光显微镜识别(FDA法)：FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。 ;酚藏花红染色法（0.1%)：酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%)：有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。 ;影响原生质体数量和活力的因素 1）光:一般在黑暗静止条件下进行. 2）温度:酶解温度25-30℃,兼顾原生质稳定性及酶活性. 3）时间:几小时到几十小时,太长影响原生质活力,一般小于24小时,如烟草叶片保温24小时叶肉细胞解离完毕. 4）细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可使用蜗牛酶和胼胝质酶。 5）渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。 6）原生质膜稳定剂 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.2-0.3%；葡聚糖硫酸钾0.2%-0.3%) 7）pH影响 5.4-6.0 ;第二节 原生质体培养;三、原生质体培养方法;（一）液体浅层培养;（二）固体平板培养 优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。 ;（三）液体-固体双层培养法 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定