第二章基因工程的基本原理详解.ppt

D 基因工程的支撑技术 A 重组DNA技术的理论基础 B 基因的分子生物学 C 基因工程的基本原理 D 基因工程的支撑技术 第三节 基因工程的支撑技术 实时荧光定量PCR （Real-time PCR） RNA blot (northern) DNA blot (southern) Dot blot Dot blot 蛋白质的生物合成 ? ? ? ? ? 氨基酸活化 肽链的起始 肽链的延伸 肽链的终止 新合成多肽链的折叠和加工 ? ? ? 转录水平上的调控 mRNA加工成熟水平上的调控 翻译水平上的调控 2.3.2 基因的表达调控 * lacI 调节基因 lacZ lacY lacA DNA mRNA β -Galactosidase Permease Transacetylase Protein 结构基因 PlacI Plac Olac The LAC operon 原核生物基因的表达调控 ①阻遏蛋白的负调控 调控基因 ②CAP正调控 真核生物基因的表达调控 DNA水平的调控 转录水平的调控 (transcriptional regulation) 转录后水平的调控 (post transcriptional regulation) 翻译水平的调控 (translational regulation) 翻译后水平的调控 (protein maturation) 真核生物基因表达调控的特点和种类 真核生物DNA水平上的基因表达调控 真核生物转录水平上的基因表达调控 顺式作用元件和反式作用因子 真核基因他水平上的调控 RNA的加工成熟、翻译水平的调控、翻译后水平的调控 基因丢失 基因扩增 基因重排 DNA甲基化状态与调控 染色质结构与调控 DNaseI超敏感位点 基因座控制区（LCR） 核基质结合区（MAR） 2.4 自然界的基因转移和重组 接合作用 ? 细菌之间通过菌毛相互接触时，质粒便可从一个细胞转移至另一细胞，这种类型的DNA转移称为接合作用（conjugation） 。 ? ? 转化作用（transfromation） 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞 或培养的受体细胞获得新的遗传表型。 转导作用（transduction） 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来再次 感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与 受体细胞之间的DNA转移及基因重组方式。 转化及转导 溶菌途径 溶源途径 噬菌体感染宿主的结果: 核酸凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细菌转化转染技术 DNA序列分析技术 寡核苷酸合成技术 基因定点突变技术 聚合酶链反应（PCR）技术 基本原理 (PCR—Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应) 一个DNA经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 。 PCR 技术 反应体系 DNA模板；dNTPs；+Tris·HCl缓冲液；引物；DNA聚合酶 循环 90℃变性30″； 50℃退火30″； 75℃延伸 1′；进入第N次循环 。 PCR原理示意图 锚定PCR（Anchored PCR，A-PCR）或称RACE PCR 种类 反向PCR （inverse PCR） 该法可用于扩增已知 序列两侧的未知序列 反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 主要用于mRNA的PCR扩增 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time?PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative?PCR)或者RTQ-PCR(real-time?quantitative?PCR)。 实时PCR(real-time?PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。 定量PCR（Q-PCR）还有半定量semi quantitative?PCR。 real?time?PCR?的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds?DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。 TaqMan荧光探针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团