第三章蛋白质详解.ppt

二、粗分级（rough fractionation) 在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH4)2SO4、NH4Cl等。（分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。） 常用的是乙醇、丙酮。 （一）盐析法 （二）有机溶剂沉淀法 利用蛋白质在等电点时溶解度最小这一特性，可以调溶液的pH，尽量接近它的等电 点，而使蛋白质沉淀。 （三）等电点沉淀 （五）透析和超滤 超滤法 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量 的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 三、细分级（fine fractionation) （一）分配层析法(chromatography) （二）离子交换层析法 （三）凝胶过滤层析 （四）亲和层析 （五）电泳法(Electophy) (三).气相色谱法 分配系数 : Kd = CA CB CA：一种物质在A相（流动相）中的浓度 CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度 层析即色层分析，也称色谱。利用混合物在互不相溶 的溶剂中分配系数的差异，而将它们分离的层析方法。 （一）分配层析 1.纸层析 单向纸层析图 双向纸层析图 将支持物涂于薄板上的层析方法。 支持剂：纤维素粉、 硅胶、 氧化铝粉 基本步骤： 铺板、点样、展层、现色、定性（定量） 2.薄层层析 2.分配柱层析 离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。 （二）离子交换层析 原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 ◆ 这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。 离子交换树脂： 基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。 化学本质：是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。 阳离子交换树脂--酸性非常强的磺酸根SO3－（以盐的形式出现）;酸性弱的-COOH 阴离子交换树脂--碱性非常强的-N(CH3) 3OH; 碱性弱的-NH3OH 应 用： 利用阳离子交换树脂分离下列每一对氨基酸，判断哪一种氨基酸首先被 pH7 的缓冲液从离子交换柱上洗脱出来。 （a）Asp和Lys（b）Arg和Met（c）Glu和Val 答：（a）Asp（b）Met（c）Glu 也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。 常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex） 聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-Gel P) 琼脂糖凝胶(商品名因生产厂家而不同) （三）凝胶过滤(gel filtration ) 也叫凝胶过滤层析 （四）亲和层析 这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的一种方法。 蛋白质 ＋ 配体 蛋白质配体复合物 这种分离纯化方法由于专一性强，理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。 （五）电泳 带电颗粒在电场中移动的现象。（不同的蛋白质所带净电荷种类、数量不同，分子大小不同、形状不同导致迁移率不同，在电泳时可以分开。） 1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 2. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 （1）纸上电泳：用滤纸作支持物。 （2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。 + — － + 3. 等电聚焦电泳： 等电聚焦电泳是利用聚丙烯酰胺凝胶内的两性电解质在电场作用下在凝胶内沿电场方向形成一个pH梯度。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。 当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。 + + － － － － + － － － － － 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 5.0 6.0 7.0 稳定pH梯度 通电 + + － － － － +