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食用菌栽培课件24 第九章菌种的分离、提纯、扩大、培养与保 第一节菌种的分离与提纯 三、菌种的提纯 如果分离的菌种已污染，可以使用相应的办法除掉。 (一)使用抑制培养基 (二)排除细菌或酵母菌污染 (三)排除霉菌污染 (四)菌丝再提纯 (五)单根菌丝提纯技术 (六)菌丝生长速度、生长量的测试 使用抑制培养基 从腐朽严重的木材块上分离菌丝时，新生菌常会伴随着各种各样的细菌、霉菌出现。 在这种情况下，可向培养基中加入选择性强的抗菌剂，如涕必灵(TBZ)或多菌灵(MBC)。 抗细菌的如培养基加入30mg/L左右的四环素或氯霉素等，以抑制细菌的出现。此外，也可以在培养基内添加链霉素30～40mg/L或金霉素20～30mg/L或高锰酸钾50mg/L。 排除细菌或酵母菌污染 组织分离，基内菌丝分离将分离物接种在无冷凝水、硬度较高的斜面培养基上，再降低培养温度至15～20℃。利用某些大型真菌在较低的温度下，菌丝生长速度比细菌菌苔蔓延速度快的特点，用尖细的接种针切割菌丝的前端，转接到新的试管斜面培养基中培养，连续2～3次就能获得所要的纯菌丝。 也可以用接种铲将斜面污染的细菌菌苔铲除掉，打破试管，挑取内部有基内菌丝的琼脂块，移入无冷凝水的培养基上。 适合于菌龄较长、被好气性细污染的试管。 排除霉菌污染 分离培养后，若发现有色的霉菌小斑点污染，最好放弃。如由同一材料分离得来的，每支试管都是如此，那就要重新分离。 如果霉菌菌落刚出现孢子，孢子尚未成熟，尚未变色，则可采用前端菌丝切割法提纯。 如果霉菌菌落的颜色已加深，则意味着众多的孢子已成熟，若采用前端菌丝切割法提纯意义不大。 可将1%多菌灵的湿滤纸盖在霉菌的菌落上，以防止提纯时，试管振动使孢子扩散。然后，用火焰灭菌过的接种铲将分离物表层铲掉，随之，用另一接种针钩取分离物位置下的基内菌丝。 霉菌的污染还常见于棉塞上，这多是棉塞受潮所致。 (四)菌丝再提纯 采用切割法或基内菌丝挑取法提纯后，一般都能获得纯菌丝，但也偶有提而不纯的现象发生，这就必须对菌丝再提纯。 为了判断提纯后菌落的纯度，将菌丝块接入琼脂培养皿平板培养基内，如果纯种菌丝，菌落会逐渐向四周辐射状散开，外缘整齐，如果菌种不纯，混有其它丝状真菌，菌丝生长速度不一，菌落外缘便参差不齐，培养皿内产生的色素也分布不匀。 再提纯时，对菌落中生长速度较为一致的部分施行菌丝前端切割，移植至新的培养基。 单根菌丝提纯技术 将怀疑混有杂菌的菌丝，用尖细的接种针切割带有培养基的菌落前端2～3mm2的薄片，移接入PDA培养基，每支试管可移接数点，放在所分离的菌种的最隹温度下培养，隔12小时后，在阳光下观察各接种块菌丝生长的状态。 选取菌丝显现出分叉状，用锋利的接种针仔细地将贴在培养基面上的单根菌丝带培养基切割下来，移入PDA培养基内，塞上棉塞，再用放大镜观察判断是否为单根菌丝，则应继续培养12～24小时后，再重复上述过程。 适合于菌丝生长速度快，密度不高的菌类，如草菇 菌丝生长速度、生长量的测试 菌丝生长速度或生长量的测定常用于判断菌种生长能力的优劣或在不同营养、环境条件下适应能力的高低。 将适合测试菌类的培养基填入25㎜×25㎜试管内，取略小于试管口径的小木棒轻轻插入，竖立，在木棒上方加适当的重力。再抽出木棒，洗净试管口，擦干，塞上棉塞，置入手提式高压灭菌锅中，常规方法灭菌。灭菌时间为1小时，取出冷却，即成相接近密度的培养基柱。 菌丝生长速度、生长量的测试 在无菌条件下，接入菌龄长短一致，接种块大小 尽量一致的菌丝块。竖放并适温培养。待菌丝蔓延1cm左右，用记号笔在试管上沿菌丝前沿画线。 数日培养后，再划出终止线，这样就容易计算出日生长速度。 每样品重复3次。通过不同样品间的比较，就能从中弃弱留强。 但必须指出，菌丝生长速度量快的，并非出菇最快。产量与质量皆好的菌株，还要进一步做试验，确定。 第二节菌种的扩大、培养 一、菌种的扩大 经分离、提纯、出菇试验确定为生产用种后，为了适应生产栽培需要，要进行菌种的扩大、繁殖。 二、贴标签 无论是菌种分离、提纯，还是一级、二级或三级种的扩大，无菌操作后应马上贴标签。 三.菌种培养 培养室内温度、湿度、光照、空气等条件彼此联系，互相影响。 (一)一级菌种的扩大培养 1.单一菌丝类型一级菌种的扩大培养 (1)单一菌丝类型一级菌种接种无菌操作要点 a在无菌箱内，将待接的斜面试管(无冷凝水)、购来或自行培养好的一级原始种，酒精灯、火柴盒、接种针等放入接菌箱内。 单一菌丝类型一级菌种接种无菌操作要点 b按接种箱操作规程进行消毒。 c打开工作灯，用75%的酒精棉球擦双手，伸入接种箱内，再擦接种工具。 d点燃酒精灯。 5右手持接种针，将顶端烧红，并将整支接种针过火几次。 6用左手手指和手掌托持两支试