生物工程本科基因实验_new_new重点分析.docxVIP

基因工程试验 绿色荧光蛋白（GFP）在E·coliBL21中的表达 前言 绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光（第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置）。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 应用： 1． GFP作为报告基因GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。 2． GFP作为融合标签 GFP最成功的一类应用就是把GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。　　3.作为生物传感器 4. 检测pH 野生型GFP和其许多突变体都具有依赖于pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH。　　3.2.2 检测卤素离子 YFP（H148Q）变体不但对pH敏感而且对不同离子也同样敏感，故可以用来检测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递［17］。 5. 其他检测应用 另外，GFP可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为Ca2+指示剂［18］。 6. GFP在细胞生物学上的应用 GFP具有同宿主蛋白构成融合子的性质，利用这一性质，可以将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中，进行细胞生理过程、细胞动力学等的实时观测，或直接应用于定量分析。 7.GFP在筛选方面的应用 1）． GFP用于细胞的筛选 基于GFP的荧光特性，并且荧光稳定以及检测方法快速、方便，GFP在细胞筛选上得到应用广泛。2）.GFP用于药物的筛选 利用GFP对目的物进行标记，追踪GFP，分析目的物在细胞中的变化情况，如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化，从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物。 一．材料 1.1试验仪器 1.5mL离心管，0.2mLPCR管，1mL吸头，100uL吸头，10uL吸头，1mL移液器，100uL移液器，10uL移液器，电泳仪，三角瓶，试管，烧杯，量筒，记号笔，IPTG，氨苄青霉素，TAE缓冲液及其配制，琼脂糖凝胶板及其制备。 1.2试验试剂 大肠杆菌菌株：E. coli JM109；E. coli BL21 质粒：pCAMBIA还有GFP基因，作为模板；pMD19-T克隆载体（T载体），用于PCR产物的克隆；pET21b大肠杆菌中的表达载体，表达外源基因用。 培养基：LB液体培养基，LB固体培养基。 试剂：taqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，氨苄青霉素，限制性内切酶：EcoRI，HindIII；IPTG；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），大肠杆菌感受态（takala，大连宝生物公司）；琼脂糖，TAE buffer，PCR相关试剂：10Xbuffer，dNTP，Mg2+, H2O。 二．试验方法 实验路线：用pCAMBIA载体作为模板----PCR扩增GFP基因---- DNA电泳检测有无PCR产物----PCR产物和T载体连接----转化大肠杆菌JM109，涂0.2mL菌液和氨苄青霉素于LB平板，37C培养过夜----含重组质粒（pMD18T-GFP）阳性克隆的筛选----阳性菌株接种5mL LB液体试管----37C培养过夜----提质粒（质粒提取试剂盒）-----酶切质粒（EcoRI/HindIII），同时将pET21b载体做同样双酶切----电泳观察----回收pET21b载体和GFP基因片段（胶回收试剂盒）----GFP和pET21b连接----转化大肠杆菌JM109，涂0.2mL菌液和氨苄青霉素于LB平板，37C培养过夜----挑取阳性克隆----接种5mL LB液体试管，37C培养过夜----提质粒-----转化大肠杆菌BL21-----涂0.2mL菌液，IPTG和氨苄青霉素于LB平板，37C培养过夜-----此日在紫外线下观察结果，看是否有绿色荧光出现在大肠杆菌菌落上。 2.1 PCR扩增GFP模板（25ul） 2.1.1在灭菌的PCR管里，依次加入： ddH2O 16.5μ l 10× PCR Buffer（