第十八章高效液相色谱法详解.pptVIP

第十八章 高效液相色谱法high performance liquid chromatography；HPLC 秦汤（药学本科一班） 高效液相色谱法基础 1.HPLC的定义与其他色谱法的比较 2.HPLC的主要类型 3.HPLC的固定相 4.HPLC的流动相 5.正相键合相色谱法 6.反相键合相色谱法 7.反相离子对色谱法 8.其他高效液相色谱法 a.化学键合相的种类 b.化学键合相的性质 键合反应 目前使用的化学键合相主要为硅氧烷（Si-O-Si-C）型键合相，是以氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应而制得。（ODS是以十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基反应键合而成） 含碳量和覆盖度 键合相表面基团的键合量，可通过对键合硅胶进行元素分析，用含碳的百分数表示。（ODS的含碳量可以在5%-10%的范围） 基团的键合量可用表面覆盖度表示，即参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。 为减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，即封尾（end-capping），封尾后的ODS吸附性能降低，稳定性增加 1.使用硅胶基质的化学键合相时流动相中水相的pH应维持在2-8，否则会引起硅胶溶解，但硅-碳杂化硅胶等为基质的键合相可用于很宽的pH范围（如pH2-12） 2.不同厂家，不同批号的同一类型键合相也可能表现不同的色谱特性 c.其他种类的固定相 键合型离子交换剂 定义：以硅胶为载体的键合型离子交换剂是在全多孔（或薄壳型）硅胶的表面，用化学方法剑和上各种离子交换基团 优点：有耐压，化学和稳定性好，分离效果高。 类型：阳离子型键合相是强酸性磺酸型（-SO3H） 阴离子型键合相是季铵盐型（-NR3Cl） 弱酸（碱）型离子交换剂（pH4-8离解影响大） 强酸（碱）型离子交换剂（在很宽的pH范围 完全离解） 手性固定相（CSP） 分类：根据键合的手性选择物的结构特征和手性分离机制，可以分为蛋白质CSP，多糖CSP，配体交换CSP等。 亲和色谱固定相 定义：由载体和键合在其上的配基组成，为了避免载体的立体障碍，使溶质能更好地接近配基，在配基和载体之间还有一合适长度的间隔臂。 HPAC固定相的载体：小粒径的刚性或半刚性的惰性物质（多孔硅胶） 2.流动相对分离的影响 分离方程式： 在HPLC中，n由固定相及色谱柱填充质量决定， 主要受溶剂种类的影响， k受溶剂配比的影响。 溶剂不同 分子间的作用力不同 1 溶剂的配比改变，洗脱能力改变，同时组分的k也改变 （增加强溶剂的比例，洗脱能力增强，使k变小） 描述溶剂极性的方法很多，最实用的是斯奈德（Snyder）提出来的溶剂极性参数 纯溶剂的极性参数定义为： 反相键合相色谱法的溶剂强度常用另一个强度因子S表示，在正反相色谱中，溶剂的洗脱能力大体相反。例如，在正相洗脱时，水的洗脱 最强 （ 最大，为10.2），在反相洗脱中，水的洗脱能力最弱（S最小，为0）. （2）混合溶剂的强度： 正相色谱法 反相色谱法 （3）溶剂的选择性 反映溶剂的质子接受能力 反映溶剂的质子给予能力 反映溶剂的偶极作用力 （8）其他高效液相色谱法 （一）离子色谱法 定义：指将改进后的电导检测器安装在离子交换树脂柱的后面，以连续检测色谱分离的离子的方法。 分类：抑制型（双柱型）和非抑制型（单柱型）离子色谱法 应用：离子色谱主要用于测定各种离子的含量，特别适于测定水溶液中低浓度的阴离子，例如饮用水水质分析，高纯水的离子分析，矿泉水、雨水、各种废水和电厂水的分析，纸浆和漂白液的分析，食品分析，生物体液(尿和血等)中的离子测定，以及钢铁工业、环境保护等方面的应用。 （二）手性色谱法 定义：采用手性固定相或手性流动相添加剂分离分析手性异构体（对映体）的色谱技术。 原理：液相色谱和气相色谱都可以进行手性异构体分离。它利用手性固定相或手性流动相中的手性试剂与被测手性异构体分子的空间和特异相互作用的差异，将对映体拆分开。 应用：手性色谱在生物和医药领域具有重要应用。 （三）亲和色谱法 定义：利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂试样中分离和分析能产生专一性亲和作用的物质的一种色谱方法 原理：将相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的