《生物化学实验手册》要点.doc

生物化学学时： 学分：课程属性：专业必修课 开课单位：华侨大学生物医学学院 先修课程：高等数学、普通物理学、无机及分析化学、有机化学 课巩固和加深对课程中基本理论知识的理解，学生必须完成基本要求：拟定记录表格写出氨基酸的分离鉴定—纸层析法紫外分光光度法测定蛋白质的含量 Bradford法测定蛋白质的含量Folin-酚法测定蛋白质的含量 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 脲酶的动力学研究 用正交法测定几种因素对酶活性的影响 DNA的提取与测定 琼脂糖凝胶电泳实验 还原糖和总糖的测定可溶性糖的硅胶G薄层层析 维生素C含量的定量测定 卵磷脂的提取、纯化和鉴定实验：氨基酸的分离鉴定—纸层析法 一、实验目的 通过对氨基酸的分离，学习运用纸层析法分离氨基酸混合物的基本原理，掌握纸层析的操作方法。 二、实验原理 纸层析（Paper Chromatography，简称PC），是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上有亲水性的羟基，通过吸附一层水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。物质被分离后在纸层析图谱上的位置用Rf值（比移值）来表示： Rf值 = 原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离 在一定条件下某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等多种因素影响。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多均会影响的有效分离。无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸纸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作为显色剂，本实验采用茚三酮作为显色剂。 三、仪器与试剂 （一）实验器材 （1）层析缸 （2）（3）喷雾器（4）培养皿（5）电吹风机 （6）层析滤纸 （7）直尺 （二）实验试剂 （1）扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份冰乙酸的混合物。将20毫升正丁醇与5毫升冰乙酸放入分液漏斗中与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 （2）氨基酸溶液：mg/mL的赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸溶液以及它们的混合液。 （3）显色剂：0.5%水合茚三酮正丁醇溶液。 四、操作步聚 1. 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中，取长22厘米，宽14厘米的层析滤纸一张，在滤纸的一端距边缘2-3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，等待点样。 2. 点样：用毛细管将各氨基酸样液分别点在7个位置上，注意一定要每个点用一个毛细管，避免混用污染。样点干燥后再点2-3次，每点在滤纸上的扩散直径范围在3毫米内为最佳。 3. 扩展：用针线将滤纸缝成圆筒状，注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸垂直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米，待溶剂上升至距离滤纸上端2厘米左右时取出滤纸，用铅笔在溶剂前沿划一边界线，自然干燥或用电吹风机吹干溶剂。 4. 显色：用喷雾器均匀喷上0.5%茚三酮正丁醇溶液，然后置100℃烘箱烘烤5分钟或用电热风吹干即可显出各层析斑点。 5. 计算各种氨基酸的Rf值。 五、思考题 为什么不同的氨基酸有不同的Rf值，影响本实验Rf值精确性的因素有哪些？实验： 紫外分光光度法测定蛋白质的含量 一、实验目的 蛋白质的含量掌握紫外分光光度紫外分光光度测定蛋白质含量的方法。 二、实验原理 蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点： 1．当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大是会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。 2．若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。 三、实验器材 1．紫外分光光度计2．移液管3．试管及试管架4．石英比色皿 四、材料与试剂 1．标准蛋白质溶液：准确称取经凯氏定氮校正的牛血清清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。 2．待测蛋白溶液：酪蛋白稀释溶液，使其浓度在标准曲线范围内。 五、操作方法 1．标准曲线的制作 表1