植物基因克隆方法.ppt

隋 娜 山东师范大学生命科学学院 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 二、基因克隆的核心---体外重组(Recombination) 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 PCR和细胞内DNA复制的相同点： （1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的 （2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对 原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高 PCR和细胞内DNA复制的不同点： （1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两条模板链通过变性完全打开双链 （5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不耐热 （7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的 （8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。 该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3’-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。 将差别表达条带中的DNA回收，扩增至所需含量，进行Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因 。 从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。 克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。 表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白表达载体及天然蛋白表达载体之分。 从克隆文库中分离目的克隆时主要利用核酸探针，可以是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针。 从表达文库中分离目的克隆时，因克隆片段的表达产物蛋白质具有抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以利用免疫学探针及生物功能进行筛选。表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因的分离。 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析. 运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作 。 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。 GAL4的DNA结合域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。 正是基于这一理论，酵母单杂交