新免疫组织化学技术.ppt

第三节 免疫酶组织化学技术 一、免疫酶组织化学基本原理 将酶连接在抗体上制成酶标抗体，借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下显示细胞表面或细胞内部各种抗原成分的定位。 标记酶应当满足以下要求： ①酶的活性高并且稳定； ②终产物稳定，不扩散，有良好的定位； ③酶与抗体结合不影响抗原-抗体的特异性反应； ④在组织与体液中不存在内源性酶及其底物。 常用酶类： 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP), 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)、 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GOD） HRP 底物: 过氧化氢 供氢体：二氨基联苯胺 (Diaminobenzidine, DAB) 4-氯-1-萘酚（4-chloro-1-naphthol，4-CN） 3-氨基-9乙基咔唑 (3-amino-9- ethylcarbozole, AEC) DAB + H2O2 棕色； 4-CN + H2O2 蓝色 AEC + H2O2 红色 3%过氧化氢水溶液或1%过氧化氢-甲醇液处理切片以阻断其内源性过氧化物酶，避免造成假阳性 图7-12 ABC法亲和免疫组织化学染色（DAB显色，苏木精复染） 大鼠黑质内酪氨酸羟化酶表达，箭示酪氨酸羟化酶免疫反应阳性神经元 图7-15 SABC法亲和免疫组织化学染色（AEC显色） A，胚胎第14天大鼠第三脑室周围和室管膜细胞乙酰胆碱转移酶表达； B，胚胎第14天大鼠端脑原代培养细胞内乙酰胆碱转移酶表达；箭示红色免疫反应阳性产物 AP磷酸酯水解酶， 坚固红（FR/AS-MX），产物为玫瑰红色 坚固蓝（FB/AS-MX），产物呈紫绿色 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑 (BCIP/NBT)蓝紫色 溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑 (BCIP/INT)棕红色或橘黄色 AP标记抗体进行免疫酶组织化学染色时，需在孵育液中加入左旋咪唑抑制内源性AP活性。 石蜡包埋组织中，除小肠上皮外，内源性AP基本被灭活。 AP标记抗体尤其适用于血细胞和骨髓涂片的免疫组化染色，因为造血组织有很强的内源性过氧化物酶活性，不宜采用HRP标记抗体。 AP标记抗体还可与HRP标记抗体结合使用，进行双重染色。 Prostate – Double label ? Cytokeratin 5 (m), AP substrate (blue) CD34 (m), AEC （red） GOD葡萄糖氧化酶 底物：葡萄糖为， 电子供体：NBT， 终产物：不溶性蓝紫色沉淀。 哺乳动物组织内无内源性GOD，是一种较好的酶标记物， 分子量较大（150 kDa），具有较多的氨基，在标记时易广泛聚合，不易穿入细胞，与底物反应的敏感性低，故主要用于免疫组织化学双重染色。 亲和组织化学技术 利用一种物质对组织中某种成分具有高度亲和力及可标记性的特点而显示组织中相应成分的技术 亲和免疫组织化学技术 将免疫酶组织化学和亲和组织化学结合 免疫酶组织化学能在待检抗原部位形成有色沉淀，亲合组织化学能产生有效抗原信号放大，使敏感性大大增加，背景清晰，最广泛的免疫组织化学方法。 第四节 亲和免疫组织化学技术 (一)亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法 (avidin-biotin-peroxidase complex method，ABC法) 将亲和素和偶联过氧化物酶的生物素按一定比例混合形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）， 1.原理: 生物素 (biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量