第四讲蛋白质的化学修饰.ppt

筛选交联条件 应注意：疏水交联剂要用合适的溶剂溶解（如碳二亚胺用乙醇），但应尽量配成浓度较大，使交联剂溶液加入量不超过总体积的15为宜，一般交联剂：蛋白质比例在10-100之间；控制温度、pH为最佳状态，一般情况下，碱性利于氨基交联，而低于中性pH则有利于巯基交联。 交联反应灭活或淬灭 这是交联反应的最后一步，就是向反应体系中加入可以与交联剂反应基团相竞争的过量亲核试剂，例如甘氨酸和Tris或其它试剂以避免额外的蛋白质交联。也可以加入SDS缓冲液进行漩涡振荡并在90度加热5分钟终止反应，还可以用蛋白质沉淀剂（如三氯乙酸、硫酸铵或聚乙二醇）。 交联蛋白的纯化 可裂变交联剂 含有不稳定键、交联后可以被化学裂变的双功能试剂称为可裂变交联剂，这个可裂变基团一般是二硫键和邻二醇，通常将其并入交联剂间隔段，前者通过硫醇发生还原反应而裂变，后者则通过高碘酸盐的氧化作用而发生裂变。 在交联混合物中，将可裂变交联剂与二维电泳胶结合起来的对角线方法，可以鉴定复合物中接合成对的交联产物。在与可裂变交联剂发生交联后，没有裂变剂存在下用SDS分离蛋白质，从胶上切下垂直泳带，用裂变剂打开交联，然后将胶条水平放置于SDS胶的顶部，使蛋白质在第二维胶上再根据质量加以分离。未交联蛋白质会按照分子量从高至低沿对角线迁移，每一个交联产物中窜在并在一维方向被分离开的裂变单体便会根据其分子量不同，在对角线下方迁移不同距离，这种对角线方法尤其适用于分析含有大量蛋白质组分的复杂体系。 标记的交联剂 有两类可以参入交联剂的标签有助于鉴定交联合成物，一类是包含可以被光谱法鉴别的基团，如荧光团、UV-VIS载色体、自旋标记物等；另一类是含有放射标记的基团 亲合检测及交联蛋白的纯化 最新研制的三功能交联剂除包含双功能反应基团外，还含有共价连接的配体可以通过亲合方法检测或纯化交联产物。在三功能交联剂中附加的亲合配体通常是生物素，它可以通过与链亲合素或亲合素结合而使结合物定向，将反应混合物过链亲和素柱，再以生物素洗脱可以纯化交联物。在实验室制备交联产物时常在小离心管中进行。 交联残基的鉴定 HPLC法分析肽图谱 质谱（MS） 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * ⑸巯基的修饰 半胱氨酸是蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链，常用的试剂有三类，即碘乙酸和碘乙酰胺或环乙烯亚胺；马来酰亚胺或马来酸酐；有机汞试剂如对氯汞苯甲酸，其反应分别如下 副反应 ⑹组氨酸咪唑基的修饰 常用试剂是焦磷酸二乙酯和碘乙酸，用碘乙酸烷化组氨酸残基可获得单取代或双取代的衍生物 焦碳酸二乙酯修饰组氨酸特别有用，它在中性pH下有较好的专一性，能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化，产物在240nm处有最大吸收，可用来追踪反应和定量测定。 羟胺使上述反应可逆进行，从而回收组氨酸。焦碳酸二乙酯也能使酪氨酸、赖氨酸或半胱氨酸的侧链发生相应的反应，但是在pH6时的反应速度慢，而且与赖氨酸或半胱氨酸的侧链的反应无可逆性。 ⑺色氨酸吲哚基的修饰 N-溴代琥珀酸亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸，它使吲哚基氧化成为羟基吲哚衍生物，导致吲哚基在280nm处的吸收值降低。该反应必须小心进行，若浓度过大，可使修饰的色氨酸残基处的肽键断裂。此外，酪氨酸也能与NBS作用并干扰吲哚基的测定。 各种苄基卤化物能使吲哚基环烷基化，最常用的是2-羟基-5-硝机基苄基溴及其类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。这些试剂在没有半胱氨酸残基时，对色氨酸是很专一的 带硝基取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但是能产生单一产物，避免了锍盐修饰产物的不均匀性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸 五、化学交联技术在蛋白质研究中的应用 定义：用双功能试剂或交联剂将两个分子结合起来的化学反应。 在蛋白质中，其肽链末端基团及侧链亲核基团都是交联的功能基，因此，交联技术广泛用于研究蛋白质的活性基团。目前，交联仍是研究蛋白质活性基团等的最有效，最多样化的技术之一。 该技术可用于研究蛋白质的相互作用，不但可以确定蛋白质的相邻亚基，还可以确定相互作用蛋白质间的最大间距等。 在交联时要使用交联剂（包括使用酶） 必须注意两点： 交联是一个经验过程，无法预测哪种蛋白质在何种条件下与何种交联剂发生反应，需要对各种实验条件及试剂进行筛选以获得最佳交联效果；其次，对未发生交联的原因解释要极其谨慎，即遵守“无证据并不证明不存在”的格言。 对于两个发生交