光谱法研究黄曲霉毒素B1与人血清白蛋白的结合反应.docVIP

光谱法研究黄曲霉毒素B1与人血清白蛋白的结合反应 　　摘 要 黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前发现的致癌能力最强的真菌毒素，严重危害人畜健康。人血清白蛋白（Human serum albumin， HSA）在结合、运输内源性和外源性等小分子物质方面具有重要的生理功能。研究AFB1与HSA的相互作用机理和作用过程，在分子毒理学上具有重要意义。本研究模拟在人体血液pH条件（pH 7.4，离子强度 0.1 mol/L）， 通过荧光淬灭、3D荧光法和圆二色谱（Circular dichroism， CD）等光谱方法研究AFB1与人血清蛋白的相互作用。结果表明， AFB1与HSA的内源荧光淬灭属于静态淬灭，AFB1-HSA在298， 303， 308和313 K 4个温度条件下，结合常数均为104数量级，结合位点都约为1。根据Van′t Hoff方程，AFB1-HSA体系是熵增焓减的自发过程，分子间主要作用力为疏水作用和氢键。基于Frster′s能量转移，得知AFB1 与HSA结合距离为3.31 nm。竞争结合实验表明，AFB1结合在HSA的siteI位点上，靠近色氨酸Trp-214。通过 3D荧光分析，AFB1的结合作用导致了HSA氨基酸残基微环境和二级构象发生变化。圆二色谱的分析结果表明，二者的结合使得HSA的α-螺旋含量增加。 中国论文网 /8/view-7206847.htm 　　关键词 黄曲霉毒素B1；人血清白蛋白；结合反应；光谱法 　　1 引 言 　　霉菌毒素中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1， AFB1）是目前已知的最强化学致癌物之一，能通过多种途径污染粮油等农产品、食品和饲料等，直接或间接进入人类食物链[1]。据估计，全球约有50亿人暴露于高水平的AFB1中[2]。血清白蛋白占整个血浆蛋白的52%～60%，是循环系统中主要的可溶性蛋白组分，能结合、运输许多内源性和外源性的化合物[3]，且可与外源性物质在特异性结合部位形成非共价复合物。毒素分子与血清蛋白结合，不仅会延长毒素的半衰期，而且会更有利于对器官的定位和形成高剂量毒素。此外，一旦血浆中的毒素浓度比胃肠道高很多，也会形成对毒素分子的被动吸收[4]。研究人血清白蛋白与AFB1作用的毒代动力学，对黄曲霉毒素的毒理学及其安全风险评估具有极大的借鉴意义，对于寻找低毒性的潜在竞争分子及其降低在体内吸收提供理论依据。 　　荧光光谱是研究小分子与蛋白相互作用的重要手段[5～7]，而圆二色谱技术可以从蛋白质二级结构变化的层次讨论小分子与蛋白质作用情况。目前利用荧光、CD技术研究药物与蛋白质的相互作用已有许多报道，但研究外源性毒素分子与血清白蛋白作用的报道还较少。本研究利用多种分析技术研究了模拟生理条件（pH 7.40，离子强度0.1）下AFB1与人血清白蛋白的相互作用。先对加入AFB1的各浓度AFB1-HSA的荧光值进行校正，再利用修正的双对数方程分别求出反应的结合常数和结合位点数，由Frster′s能量转移确定了AFB1与色氨酸残基的距离，并根据热力学参数确定了它们之间的主要作用力类型，以酮洛芬和布洛芬讨论了AFB1在人血清白蛋白上的结合位置，同时结合3D荧光和圆二色谱讨论了AFB1对HSA的二级结构的影响。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）； F-4500荧光分光光度计（日本日立公司）；MOS-450圆二色谱仪（法国Bio-logic公司）。 人血清白蛋白（Human serum albumin，HAS， Sigma 公司），使用时用缓冲液配制成0.1 mmol/L。黄曲霉毒素B1（AFB1，纯度≥98%，Sigma公司），使用前用甲醇配置成浓度为4.0 mmol/L， 4℃避光保存。酮洛芬（Ketoprofen，纯度≥99%，上海化学技术上海有限公司）；布洛芬（Ibuprofen，纯度≥98%，北京百灵威科技有限公司）。上述试剂使用前都用无水乙醇配制成4.0 mmol/L，其它试剂都为分析纯。用0.1 mol/L Tris， 0.01 mol/L HCl和NaCl最终配制成含0.1 mol/L NaCl，pH为7.4的缓冲液。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 “内滤光效应”的校正 由于黄曲霉毒素在荧光激发波长280 nm处有吸收，随着样品中毒素浓度增加，其淬灭行为存在内滤光效应，需要按下列操作对实验数据进行校正。在1 cm比色皿中加入2.0 mL缓冲液， 用微量进样器加入适量4.0 mmol/L AFB1溶液，使AFB1浓度分别为2.0， 4.0， 6.0， 8.0， 10.0， 12.0， 14.0， 16.0， 18.0和20.0 μmol/L，混匀后，扫描紫外波段190～500 nm