7聚合酶链反应精要.ppt

浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 * 保证模板DNA解链完全，是整个PCR扩增成功的关键。再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。 * 50-60度 * 一般1kb/min * 设计特异性高的引物，是提高PCR特异性最重要的方法之一 * * Taq酶最佳活性温度在72°，但在低温时仍有活性，所以热循环刚开始，引物与模板的非特异性配对产生非特异性产物，且会被有效扩增 * Hot Start with AmpliTaq Gold? DNA Polymerase 在传统的PCR反应中，极易发生引物错配和二聚体的形成，继而导致非特异性产物的扩增。 延缓加入必须成分，当达到变性温度在加入 * 图1为热启动方式下的PCR产物电泳结果；图2为传统启动方式下的PCR产物电泳结果，两种启动方式下的反应的体系及条件均一致。 从图中可见，热启动方式下的PCR产物的电泳结果较为理想，目的条带清晰，非 特异性条带较少，且条带拖尾现象较弱；而传统启动方式下的PCR产物的电泳结果就 不是十分的理想，虽可见目的条带，但条带较为模糊，拖尾现象较为严重。 ? * 据报道通过向PCR反应体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。目前关于PCR反应促进剂对扩增效率的影响机制尚不清楚，可能是添加剂消除了引物和模板的二级结构，降低了DNA的解链温度使双链DNA变性完全。同时PCR反应促进剂还增进DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR反应起抑制作用，故在实验中应根据具体的情况选用适当浓度的PCR促进剂。 * DNA的双链主要是靠氢键联系在一起。 退火温度越高，断开氢键的热能越大，引物与模板越不易结合，反之，退火温度越低，越容易形成氢键，进行退火。 所以当温度高时，只有碱基匹配程度高的，也就是模板与引物形成配对数越多的引物，才能结合到模板上，这样扩增出来的条带最少，甚至只有一条，也就是引物和目的序列的完美匹配， 因此特异性越高。 反之，若退火温度低，引物和模板匹配低时，也能稳定存在，那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配，进行引发，因此dna条带会很多，非特异带增加。 特异带是指你的目的带。非特异带是PCR中扩增出的非目的带。 退火是指温度下降，单链DNA与引物结合的过程。温度过低，可造成引物与模板之间只需有一小段可以互补配对就能配对，造成非特异性产物增加。而温度高时，需要引物与模版之间有较长的互补配对序列才能相互配对，特异性增强。任何生理行为的进行都需要能量， * * 样品在紫外灯下观察、成像。 * 聚合酶链式反应—限制性片段长度多态（PCR— RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。 * 利用致病基因内外的限制性片段长度多态性（RFLP）作为特异分子遗传标志物，通过家系成员间的连锁关系确定血友病基因的遗传情况，进行DNA多态性分析的遗传学诊断(RFLP，VNTR，STR等方法)，可使诊断率达99%。 血友病是一组先天性凝血因子缺乏以致出血性疾病。先天性因子Ⅷ缺乏为典型的性联隐性遗传，由女性传递男性发病，控制因子Ⅷ凝血成分合成的基因位于X染色体。 * 对于一段DNA来说，其单链具有特定的空间构象，这种空间构象的形成与该段DNA的碱基序列有关，当这段DNA发生突变，基碱基序列亦发生相应的变化，空间相象亦随之改变，研究发现，不同空间构象的DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时的迁效率有所不同，这样对于同一段单链DNA来说，这种空间构象的变化及电泳迁移的改变即能说明其有突变的发生因此，可用经PCR扩增的DNA片段经变性成单链然后在中性胶中电泳，即可检出有无突变 . * * * 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 * * * 1． 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有