2014全日制研究生-蛋白质组学概要.ppt

蛋白质组研究的必要性 蛋白质组学的研究内容 1、蛋白质组表达模式（组成）的研究 蛋白质组成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质的发现、同源蛋白质比较、蛋白质加工和修饰分析。 2、蛋白质组功能模式（作用）的研究 基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析。 重要生命活动的分子机制（如细胞周期、分化与发育、环境反应与调节等）。 医药靶分子的寻找和分析（包括新药靶分子、肿瘤分子标记、人体病理介导分子等）。 3.2.3 蛋白质组研究技术 一、双向凝胶电泳技术 二、液相色谱技术 三、生物质谱技术与蛋白质鉴定 四、蛋白质相互作用的研究技术 一、双向凝胶电泳技术（一）2-DE的概念two dimensional gel electrophoresis 2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDS组成的分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离，SDS则是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离。 1、第一向电泳―IPG等电聚焦电泳 1）等电聚焦电泳的基本原理 等电聚焦（IEF）是60年代发展起来的一种蛋白质分析分离手段，如图所示，在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。这种不同的蛋白质分别聚集在各自的pI处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象称为等电点聚焦。 2、第二向电泳―SDS- PAGE 1）SDS的原理 在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质的分子量大小。 双向电泳的流程 样品制备 第一向等电聚焦 第二向SDS凝胶上蛋白的检测 蛋白的软件的检测 （二）凝胶上蛋白质的检测 蛋白质样品经2-DE分离后，凝胶上的蛋白质斑点须用一定的方法使其显现出来，让仪器或人眼检测到。 （一）考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色方法。考马斯亮蓝R-250化学名为三苯基甲烷，R代表红蓝色。考马斯亮蓝R-250与蛋白质的碱性基团可逆结合，染色线性范围可达1～55μg，灵敏度为30～100ng蛋白质。考马斯亮蓝染色的最大优点是染色重复性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定，灵敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于银染色和荧光染色，不能满足对低丰度蛋白质的检测要求，样品用量大。 （二）银染色 原理 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在碱性pH条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而呈显棕黑色。银染色灵敏度很高，是考马斯亮蓝染色法的100倍，但操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝染色，对糖蛋白、钙结合蛋白的染色效果差。 (三) 荧光染料染色 荧光染料染色法是利用结合于蛋白质的荧光染料发出的荧光来检测蛋白质。用于蛋白质染色的荧光染料很多，有的共价结合于蛋白质上，有的和蛋白质形成非共价结合。目前商品化的荧光染料有SYPRO Ruby, 其染色方法操作简便，灵敏度高达1～10ng，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影响后续的质谱鉴定，是一种较理想的蛋白质染色方法，但价格较昂贵。 （三）双向凝胶电泳图谱的计算机分析 细胞或组织样本经2-DE分离后，得到一张含有成百上千个蛋白质斑点的凝胶电泳图谱。凝胶图谱分析包括确定蛋白质斑点的位置、大小、染色深浅、pI和分子量；图谱间的比较、差异蛋白质斑点的确定；图谱质量的优化、数据的储存管理、数据库分析等内容。借助先进的计算机技术和生物信息学工具，能客观、有效地从电泳图谱中提取到有价值的信息。 （四） 2-DE的分辨率、重复性及局限性 2-DE系统有很高的分辨率。商品化的IPG胶条以及标准化的实验操作使得2-DE具有很高的重复性，可在不同实验室间进行图谱的比较，给蛋白质组数据的共享带来了极大的方便。目前没有一种分离技术在分辨率上能与双向凝胶电泳相媲美。 2-DE存在的不足和缺陷： 首先，2-DE的分辨率仍不能满足蛋白质组学研究的需要，人类基因组有