CRISPRCas概述概要.pptVIP

规律成簇间隔短回文重复序列再利用， 作为一种RNA引导的序列特异性调控基因表达的平台 type II CRISPR system from Streptococcus pyogenes 基因组范围的定向基因调控是一种探寻、扰乱和编辑细胞系统的有效手段。 这个被我们称作CRISPR干扰的系统，在大肠杆菌中能够有效抑制目的基因的表达，并且没有脱靶现象发生。CRISPRi能够用于多个基因的同时沉默，而且该效应是可逆的。我们也找到了该系统适用于哺乳动物细胞基因表达抑制的证据。 该RNA诱导DNA识别的平台为基因组范围内有选择性的干扰基因表达提供了一个简单的方法。 实验结果 与Cas9共表达的sgRNA分子都由三个片段组成：一个20个核苷酸（nt）位点特异性互补区，一个42nt Cas9结合发夹（Cas9 手柄），和一个40nt来自生脓性链球菌的转录终止子 Growth of E. coli Cell Cultures Cotransformed with dCas9 and sgRNA position on silencing efficiency 利用CRISPRi基因敲除探寻一种内源调控网络 我们分别在IPTG（一种抑制LacZ阻遏物的化合物）有或无两种情况下进行β-半乳糖苷酶实验来测定敲除菌株中LacZ的表达。 结果显示一个LacZ特异性sgRNA能够强烈抑制LacZ的表达（图6B）。 相反，一个定位lac I基因的sgRNA导致在没有IPTG的情况下激活LacZ的表达，正如预期的沉默了一个LacZ表达的直接抑制子。 已知cAMP-CRP是LacZ表达的关键激活子，它结合于启动子上游一个顺式调剂位点（A位点）。 同样，sgRNA定位于crp基因或LacZ启动子中的A位点导致抑制，证明一种利用CRISPRi实验将一个调节子联系到它的顺式作用序列的方法。 定位腺苷酸环化酶基因（cya）是产生cAMP使CRP在LacZ启动子上更有效所必需的，这只导致部分抑制。添加1mM cAMP 于培养基中补充了cya基因敲除的影响，而不是为补充了crp敲除的影响，说明cya是LacZ非直接调节因子。 另外，利用sgRNA定位LacI反式调节位点（O位点）引起抑制，推测是由于Cas9复合物结合于这一位点空间阻碍RNA聚合酶的结合，这模仿了LacI转录抑制子的行为。 定位已知RNAP结合位点（P位点）也阻碍表达。 总的来说，这些研究证明了基于CRISPRi的基因敲除方法提供了一种快速有效的方法来探究基因和反式作用元件在复杂调控网络中的功能（激活或抑制）。 CRISPRi能够在人类细胞中敲除基因表达 讨论 一、CRISPRi高效并选择性抑制目的基因的转录 二、CRISPRi能够用于基因组范围的分析和调控 CRISPRi方法基于sgRNA的使用，只需要根据目的基因设计20bp的互补区。利用先进的大范围DNA寡核苷酸合成技术，产生大量用于基因组定位的含有特异20bp区域的寡核苷酸是十分快速和廉价的。 这些寡核苷酸文库能潜在的使我们定位大量单一的基因来研究基因功能或者定位基因对来标注基因互作。 进而，CRISPRi能够用于同时调节大范围基因的表达，因为小sgRNAs能将多个元件连接到同一个表达载体。 三、CRISPRi作为管理转录调控网络的平台 在CRISPRi系统中，也可能是将多个sgRNAs连接到一个转录体系中，从而实现一个上游sgRNA调控不同下游sgRNA的表达。 ;, thanks Result 7 ?将dCas9蛋白密码子最优化，融合到三个拷贝的核定位序列（NLS），并利用小鼠干细胞逆转录载体表达。 ?sgRNA用RNA聚合酶ⅢU6启动子表达。 ?通过病毒侵染创建了一个在SV40启动子下表达EGFP的HEK293报告细胞系。 Result 8 CRISPRi不依赖于复杂的宿主因子，只需要dCas9蛋白和引导RNAs，并且灵活性和可塑性高。 我们的结果证实在微生物中该系统能有效沉默基因。这种沉默是十分特异性的；我们的观察没有发现脱靶效应。另外，敲除效率能通过改变定位位点和sgRNA与目的基因之间碱基配对程度加以改变。 该系统通过直接阻碍转录发挥功能，可以很容易的通过设计sgRNAs来实现。 另外，这些dCas9：sgRNA复合物也能在任何启动子中通过定位关键反式激活结构域调节转录，空间上阻碍它们同源的顺式激活因子。 讨论 讨论 * D10A 天冬氨酸Asp 丙氨酸Ala H841A 组氨酸His 丙氨酸 目的：测试是否会造成细胞损伤 A:转化效率 Cas9有催化活性的蛋白介导的 造成细胞不可回复性损伤 B：加不加 都不会影响细胞生长曲线 不会造成细胞繁殖分裂障碍 fluorescence-ba