ELISA技术概要.ppt

ELISA Technology 一，免疫学基础概念 ELISA 技术 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 是一种免疫学测定 ，主要通过抗原抗体反应检测液体标本中的抗体或抗原性物质，是一种应用免疫学技术测定标本中目地蛋白性质、功能及含量的方法。 一，免疫学基础概念 抗原（Antigen） 抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质 。 半抗原 能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子（载体）结合，纯蛋白会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与纯蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质（ 如青霉素、磺胺剂等 ），称为简单半抗原。当简单半抗原进入过敏体质的机体时，能与体内组织蛋白结合，成为完全抗原，这种完全抗原可引起超敏反应。一般来说，B淋巴细胞识别半抗原决定簇，T淋巴细胞识别载体抗原决定簇。 一，免疫学基础概念 抗体（Antibody） 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM 一，免疫学基础概念 抗原抗体反应 a,可逆性 b,最适比例 c,特异性 d,敏感性 一，免疫学基础概念 抗体的产生 机体受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应的抗体。含有抗体的血清称为抗血清（antiserum）。每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体，则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体，这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。 产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb或Mab）。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有很高的特异性。 单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾细胞（含产生抗体的B细胞）与小鼠肿瘤细胞融合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。 二，ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗菌素原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）； （3）酶反应的底物（Substance）。 * ? 2009 Invitrogen Corporation. All Rights Reserved. | Proprietary and Confidential. * ELISA 技术 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay） 一、概述 1. 间接ELISA（Indirect ELISA） 2. 夹心ELISA（Sandwich ELISA） 3. 竞争ELISA（Competitive ELISA） 已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上 待检标本和酶标抗原或抗体与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应 洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的成分 加入酶再作用底物催化显色，进行抗原/抗体的检测 二、基本程序 Indirect ELISA Sandwich ELISA Competitive ELISA 分类方法 1. 按待测物种类分： 测定抗原、半抗原和抗体。 2. 按酶标记物种类分： 标记测定抗原、半抗原、第一抗体、第二抗体、葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素、亲和素、核酸等 。 3. 按反应性质分： 竞争性和非竞争性 。 4. 按是否将抗原或抗体结合到固相载体上分： 固相酶免疫测定法、均相酶免疫测定法和双抗体酶免疫测定法。 5. 按与其它方法的结合使用分： 免疫印迹技术、亲和素和生物素技术、放射免疫技术、PCR技术等。 1. 固相载体和免疫吸附剂的制备 最常用的固相载体是聚苯乙烯 聚氯乙烯 硝酸纤维素膜 微孔滤膜 三、ELISA方法的技术要点 免疫吸附剂 与固相载体结合的抗原或抗体称免疫吸附剂。 包被（coatin