血管内皮细胞分化模型实验建立.docVIP

血管内皮细胞分化模型的实验建立 姓名：王国栋 院系：基础医学院中西医结合1班 学号胚胎的血管发育是发育生物学中的重要事件，血管系统的形成与胚胎发育及肿瘤的发生、转移有着密切的关系，动物胚胎学研究证明，血管的发育需要经历两个不同的阶段，即血管形成和血管生长。血管形成是指起源于中胚层的前体细胞如血管细胞在原位进行分化，形成内皮细胞，之后这些分化了的细胞组装成原始的血管，其间，内皮细胞在无管的区域分化、增殖，然后结合成分散的血管。因此血管形成过程，依赖起源于中胚层的前体细胞向血管内皮细胞的分化。近几年的研究，人们对血管发育的认识已经深入到了细胞、分子以及遗传的水平，但是，内皮细胞作为血管的主要组成部分，其分化的分子机制还不清楚，内皮细胞很容易在分化和相对未分化状态之间动荡。在成体组织中，内皮细胞表型是静止的，不仅能够快速修复损伤，更新循环系统的部分高流量和动荡的脉管内膜，而且对再生器官的循环功能有一定作用．然而，在疾病如肿瘤的生长和转移中，去分化的潜能是内皮细胞致命的缺点，因此，研究内皮细胞分化的分子机制，对研究血管发育机制以及血管新生紊乱具有重要意义。本文在前人的研究基础上成功建立了鸡胚盘细胞向内皮细胞分化的实验模型，为研究内皮细胞分化的分子机制提供了很好的方法。 材料与方法 材料 受精蛋购自云南省农业科学院家禽研究所，DMEM培养液购自Sigma公司，第一抗体及第二抗体均购自北京中山公司，其他试剂均为国产分析纯化。 X期鸡胚盘细胞的分离培养 受精蛋用新洁尔灭消毒液浸洗，75％酒精消毒后，放人超净工作台．小心剪取胚盘，并将胚盘与卵黄膜分离．放入1mL新鲜的DMEM液中冲洗2次，去除剩余卵黄，3000r/min离心3min，弃上清．将细胞重悬于含20％小牛血清的新鲜DMEM培养液中，接种于24孔板，每孔接种1个胚盘．5％CO2，37℃培养，每三天换液一次。 1.3 不同浓度FGF诱导鸡胚盘细胞分化 在分离的胚盘细胞中分别加入10～100ug/L的成纤维细胞生长因子(FGF)，每天在倒置相差显微镜下观察鸡胚盘细胞的分化情况。 免疫荧光检测 培养过程中，用免疫细胞化学方法结合激光扫描共聚焦观察，检测FGF诱导分化的胚盘细胞中凝血第VIII因子相关抗原(Factor VIII associated antigm)表达情况。将培养的胚盘细胞用10％中性甲醛同定后，按常规间接免疫荧光技术进行操作，第一抗体为兔多克降抗凝血因子VIII (Factor VIII associatedantigen)抗体，第二抗体为羊抗兔IgG-FITC．用血管内皮细胞做阳性对照，人肺癌上皮A549细胞做阴性对照。激光扫描共聚焦显微镜下观察，细胞内有绿色荧光者为阳性。 结果与分析 2.1 X期鸡胚盘细胞的分离培养 新分离细胞在倒置相差显微镜下，可见常个分散胚盘细胞。胚盘细胞24h后开始贴壁牛长，72 h后，胚盘细胞向上皮类细胞分化。 2.2不同浓度FGF诱导鸡胚盘细胞分化 分别用10～100ug/L的FGF处理分离的胚盘细胞，大于100ug/L的FGF处理胚盘细胞3天后，少量胚盘细胞向内皮细胞样细胞分化，6天后这些内皮样细胞开始融合成网络状，形成血管样结构。 2.3 免疫荧光检查 100ug/L的FGF处理胚盘细胞4周后，免疫荧光检测表明处理的胚盘细胞第Ⅷ凝血因子相关抗原呈阳性，说明100ug/L的FGF能诱导胚盘细胞向内皮细胞分化。在透射显微镜的照片下，FGF处理的胚盘细胞呈现出绿色荧光，表明胚盘细胞已分化为内皮细胞。 讨论 鸟类受精卵经过卵裂在卵黄上形成一个由胚盘细胞组成的胚盘。随着禽胚的发育，胚盘细胞首先分化出上胚层和下胚层，并由下胚层分化为内中外3个胚层。其中中胚层中最重要的两种细胞：内皮细胞和造血细胞，负责血管形成。因此，目前多用禽胚模型来研究血管发育。但是禽胚模型不能从外胚层直接诱导产生造血细胞和内皮细胞，因此，中胚层前的未诱导状态在禽胚中也不能实现。新型的胚胎干细胞分化系统中，内皮细胞、血细胞等能从共同的祖细胞-表达血管内皮FGF受体2(FGFR2)的细胞中诱导产生．这个系统可以体外观察血管发育过程的多个步骤，如血管细胞从祖细胞分化和变化，内皮细胞成熟以及向动脉、静脉及淋巴管内皮细胞分化和脉管形成。这个建设性的体外方法对阐明血管发育的细胞和分子机制提供了新的可能，但是操作比较麻烦，也需要一定的设施．Ingo、Flamme等用FGF体外诱导鹌鹑上胚层细胞分化为内皮细胞和造血细胞，这些细胞能聚集成血岛．长期体外培养，诱导分化的内皮细胞能形成血管样结构，即血管形成。因此，诱导鹌鹑上胚层分化的模型是研究高等脊椎动物内皮细胞分化极其简单的模型。但是，Ingo Flammne用罕见的鹌鹑受精卵作为研究对象，而且对培养技术及现象的描