荧光显微镜详解.docVIP

荧光显微镜 一、结构及其原理 荧光显微镜的基本构造通常由普通光学显微镜再加一些如荧光光源 、激发滤片、双色束分离器及阻断滤片等附件的基础上组成。同时采用的荧光光源一般为超高压汞灯，它可发出各种波长的光，且每种荧光物质都会有一个产生最强荧光的激发光波长 ，这时需加置激发滤片，通常有紫外、紫色、蓝色及绿色激发滤片，仅需使一定波长的激发光透过并照射到标本上，并将其他光都吸收掉。同时在每种物质被激发光照射后，更可在极短时间内发射出比照射波长更长的可见荧光。 荧光显微镜的特殊结构包括： (一)滤色系统 滤色块是荧光显微镜的重要部位，其核心部件由激发光滤色片(first barrier filter)、发射光滤色片(second barrier filter)和半透半反滤色片(beam-splitting mirror)组成。各厂家的滤色片型号、名称常不统一。---- 1.激发光滤色片及发射光滤色片：根据光源和荧光色素的特点，通常选用以下三类配套，提供一定波长范围的激发光，并使样品激发出的荧光透过，到达目镜成像。 紫外光激发：激发光滤色片可使紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。与之相应的发射光滤色片可允许蓝光通过，视野内的光呈蓝色，如应用于DAPI染色。 蓝光激发：激发光滤色片可使蓝光通过，阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片可允许绿光通过，如GFP 染色标记。 绿光激发：激发光滤色片使绿光通过，阻挡其他波段的光。与之相应的发射光滤色片通常可允许红光通过，如Rhodamine染色。 2.半透半反滤色片：它的作用是完全阻挡激发光通过，而将其反射;并透过相应波长范围的发射光。其型号与激发光滤色片和发射光滤色片相对应。 (二)物镜及目镜 各种物镜基本可以应用，但最好选用增称、消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能(波长范围)适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其对荧光不够强的标本，应使用镜口率大、光透过性高的物镜，配合以尽可能低倍的目镜。 (三)其他光学装置 反光镜，其反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上(而银的反射率只有70%)。一般使用平面反光镜。聚光镜，专为荧光显微镜设计制作的聚光镜用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。落射光装置，它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养等样品的直接观察。近年研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置，称之为落射荧光显微镜。 (四)光源 现在多采用50或100W的高压汞灯作光源。工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高(这一过程一般约需要5～15min)，并在这一过程中发射光量子，释放的光的波长足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 二、操作过程 （1）打开灯源，超高压汞灯要预热15min才能达到最亮点。 （2）透射式荧光显微镜需在光源与暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的压制滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片、双色束分离器、压制滤片的插块。 （3）用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 （4）放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊镜油；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需待汞灯完全冷却后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 （5）观察。例如：在荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，观察到经0.01%吖啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。 三、主要用途 荧光显微镜是用来看荧光标本的，它的波长短，普通显微镜是用普通可见光源看标本的。物体构造的观察——荧光素；荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等；发荧光量的测定对物质定性、定量分析。 优缺点 优点：检出能力高（放大作用）；对细胞的刺激小（可以活体染色）；能进行多重染色。 缺点：必须正确调整聚光灯中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像；不能使用厚的载玻片；视场照明区不能过大；厚的或不透明的标本不适用。