实验9RedET同源重组分析报告.ppt

1. 重组质粒的构建 (1) 传统基因克隆技术的缺点 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切 酶的消化，当缺少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，利用内切酶消化难以得到相应的产物。 方法看似简单，但实验周期长。 大片段难以与载体正确连接。 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。 限制性内切酶 连接酶 步骤1： 酶切目的片段 步骤2：酶切载体 步骤3: 目的片段与载体连接 同源重组克隆步骤 传统克隆步骤 步骤4: 重组子转化到感受态细胞 同源重组克隆 传统克隆 克隆片段长度 50bp-10kb 50bp-2kb 一次克隆片段数 1-5个 1个 感受态效率要求 1×108cfu/ug以上 1×107cfu/ug以上 所用的酶 重组酶 T4连接酶 片段的插入位点 任何位点 特定位点 片段酶切 不需要 需要 载体线性化方法 酶切或PCR 酶切 同源重组克隆与传统克隆比较 插入选择标记 插入无选择标记的DNA片段 2. 染色体的修饰 E. coli染色体上插入抗性基因 传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较 （B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小 3. 亚克隆 （Subcloning） 4. 直接克隆 （Direct cloning） （A）亚克隆和直接克隆示意图 Red/ET sub