生物工程下游技术第三章微生物细胞破碎解析.pptVIP

第三章 细胞破碎与分离 部分微生物胞内酶 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物 §3、1细胞壁的组成与结构 一、细菌 肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、半乳糖胺 氨基酸：D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸 磷壁质 糖 脂质 二、真菌和酵母 糖及其氨基衍生物 氨基酸 脂质 四、细胞结构与细胞破碎 §3、2细胞壁的破碎 一、破碎率的评价 破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： 二、细胞破碎方法的分类 1、固体剪切方法（珠磨） 原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一齐搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 设备 破碎率的动力学方程 破碎作用遵循一级动力学定律： 影响反应常数K的因数： 转盘外缘速度 细胞浓度 珠粒大小 温度 流量 2、液体剪切法（高压匀浆法） 原理：利用高压使细胞破碎。 包含体形成的可能性： 可溶蛋白的集聚超过溶解度； 蛋白合成太快，导致分子间疏水相互作用聚合而不溶； 高表达的蛋白没有形成正常的二硫键连接； 蛋白的助溶物缺乏； 包含体的形成与蛋白的稳定性有关。 外源蛋白在大肠杆菌中的积累 破碎的动力学方程： R：蛋白质释放量； Rm：蛋白质最大的释放量； p：操作压力； k：速率常数； ?：与微生物种类有关的常数 Doulach理论： Z：常数 P：破碎压力 P0：临界压力 ?：细胞浓度参数 3、超声波破碎法（液相剪切的一种方法） 原理：超声波引起空穴，在相当高的输入声能下，液体各部分会形成许多小气泡，在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能在压缩时，气泡破破裂，释放出猛烈的阵。这种震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量身能转化成弹性形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。 蛋白释放的动力学方程： 蛋白释放常数k取决于输入的声能。 超声波破碎过程中的影响参数： 振幅； 细胞悬浮液的粘度； 表面张力； 被处理悬浮液的体积； 探头的形状和材料； 细胞悬浮液的流速； 机械放破碎的缺点： 需要高的能量并且生产高温和高的剪切力，易使不稳定产品变性失活； 破碎非专一性； 碎片尺寸分布广泛。 4、酶溶法 原理：利用酶分解细胞壁上特殊的化学键使之破壁的一种方法。 优点：产品的选择性高； 抽提的速率和收率高； 产品破坏最少； 对pH和温度等外界条件要求底； 不留细胞残片。 缺点：酶的费用高；通用性差；产物抑制 分类：外加酶法；自溶法 重要微生物细胞壁的降解酶 5、化学法 原理：用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些 组分的方法。 优点：对产物有选择性 细胞外形保持完整，碎片少。 缺点：通用性差 时间长 有些化学试剂有毒性 用于化学法的试剂种类： 酸碱调节 有机溶剂 表面活性剂 EDTA鳌合剂 变性剂 不同细胞可采用的化学渗透处理方式 物理法 渗透压法 反复冻结—融化法 干燥法 X-press法 §3、3破碎技术的研究方向 多种破碎方法相结合 与上游过程相结合 培养过程控制 寄主细胞的选择 克隆噬菌体溶解基因 耐高温产品基因表达 与下游过程结合 纤维素中的?（1，4）-键 纤维素酶 藻类 聚糖中随机?（1，3）-键 聚糖中随机?（1，6）-键 （1，2）-或（1，3）-或（1，6）-?-D甘露糖苷键 甲壳糖和壳糊精中的N-乙酰-6-D-氨基葡萄糖基?（1，4）-B-键 ?-（1，3）-葡聚糖酶 ?-（1，6）-浦聚糖酶 甘露聚糖酶 甲壳素酶 蛋白酶 真菌、酵母 肽聚糖中AGA和AAM之间的?（1、4）-键残基；某些糖肽中的N-乙酰胞壁酰基残基和L-氨基酸残基之间的键；甘氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸等的肽键。 糖苷酶 N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶 多肽酶 细菌 水解键的类型 酶 生物体 * 鳌合物 * * * 巨噬细胞 * * * * 植物细胞 * * * * * * 酵母菌 * * * G+菌 * * * * * G-菌 生物试剂 抗生素 酶 有机溶剂 清洁剂 变性剂 细胞类别 * 苄青霉素的脱酰作用 Escherichia Coli 青霉素酰化酶 糖果、蜜