生物化学 蛋白质解析.pptVIP

K=VM/VR (四) 利用选择性吸附的纯化方法 1.羟基磷灰石层析 羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2(简称HA)]的吸附容量高，稳定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链DNA、单链DNA和杂合型双链DNA-RNA等，经过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。而HA的(PO4)3基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应，则仅起着次要的作用。 2.疏水作用层析 以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的方法洗脱。常用的置换剂有非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。 (五) 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 (六) 高效液相层析和快速蛋白液相层析 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)，又称高压液相色谱法 、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。 特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。 HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号， 由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。 1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多 ，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。 2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。 3.高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。 4.高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g 的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。 由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时，可用GC进行分析；沸点较高(＞450 ℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 (一) 蛋白质含量测定 1.凯氏定氮法 2.双缩脲法 3.酚试剂法 4.紫外吸收法 5.染料结合法 6.胶体金法 7.免疫学方法 8.生物活性测定法 (二) 蛋白质纯度鉴定 常用电泳法、HPLC法、免疫学方法等 基本要求 1.掌握蛋白质的酸碱性质。 2.掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。 3.掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。 4.掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 5.熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。 6.掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。 总结 一、氨基酸的结构及性质 二、蛋白质的结构 一级结构：肽的结构及性质 蛋白质一级结构及测定方法，生物功能之间的关系。 蛋白质的空间结构：二级结构，超二级及结构域，三级和四级结构 三、蛋白质结构与功能的关系 四、蛋白质的分离、纯化 * * * * 3.凝胶过滤 (二) 利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀和pH控制 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。 2.蛋白质的盐溶和盐析 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓