受体药理学解析.ppt

第五节、受体的研究方法 受体的研究方法涉及面甚广。一般来说研究受体可大体从两个方面进行： 对受体进行分离、纯化和鉴定，并在此基础上进一步对受体的结构与功能做深入的研究----直接研究 根据药物（或生物活性物质）所产生的生物反应对受体加以推测，并分析药物与受体结合的特性，所介导的生物效应及其机制，从而对药物与受体的结合方式作出确切的判断---间接研究 一、离体组织或器官生物检定法 此方法是经典药理学中的常用方法并作为受体研究的一种基本方法。 用这种方法可以直接观察药物（配体）作用于靶细胞后，所产生的生物效应并据此对受体进行推断。 优点是方法简单、快速、可定性，但对一些要通过生物转化才能形成活性的物质不适用。 二、受体的放射配体结合分析法 放射配体结合分析法是研究受体的重要方法。该方法是利用受体与配体结合的高度特异性和可饱和性以及放射性核素测定的高灵敏度的特点，达到了解受体的结合活性的目的，这就是放射配体结合分析法的基本原理。 受体研究中常用的放射配体结合分析法有结合饱合实验、结合竞争实验和结合、解离的动力学研究。 在实际的受体研究中，上述实验方法并非都要做，如何选择实验方法，必须根据所研究的目的而定。如果研究的目的是进行受体鉴定，则上述实验都需做，从中可获得受体最大结合容量（Bmax）、亲和力（KD）、结合和解离的特征，以及对配体结合的立体选择性等重要信息。 例如，α1受体对哌唑嗪有选择性作用，而α2受体则对育亨宾呈立体专一性。 值得指出的是，用放射配体结合分析法测得的只是特异结合，因此要说明所测得的特异结合是受体，则必须进一步做受体的功能鉴定。 三、受体的亲和标记和理化性质的研究 受体分离纯化后，常须对受体蛋白做进一步的理化性质的研究，超速离心、电泳、层析等技术是常规的研究方法。 SDS聚丙烯酰胺电泳是测定蛋白质分子量的常用方法，更好的方法是采用亲和标记法测定。 四、信号转导系统的研究 受体学研究仅限于对受体本身研究是不够的。我们知道，受体是指那些能特异性识别和结合相对应配体，并通过相应的信号转导系统传递信息，以产生最终生物效应的蛋白质分子。由此可见，受体是与相应的信号转导系统紧密联系的，在研究受体时，也应进行相应的信号转导系统的研究。 例如，假设已克隆出“β受体”的cDNA，除了做放射配体结合分析等研究外，还应证实它确与GS蛋白相偶联并激活了腺苷酸环化酶，这样的结果将会更令人相信。 又如，对于离子通道的受体，则可采用相应的技术，如斑片钳等技术，观察离子的跨膜流动，可以确定该受体是否属于离子通道型受体。 五、抗体技术在受体研究中的应用 单克隆抗体在受体研究中发挥着重要作用。由于抗受体抗体与受体呈高亲和力特异结合，因此是研究受体非常有用的工具。抗体技术在受体研究中的应用主要涉及以下几个方面： （1）受体的分离纯化 （2）受体的定性、定量和定位 （3）受体的分子结构的研究 如用胶体金标记单抗、可用电镜免疫组化法对膜受 体的不同表位进行定位分析； （4）受体的信号转导研究 六、分子生物学技术在受体的应用 在受体研究中，最令人感兴趣的课题是研究受体的分子结构以及结构与功能的关系，这也是研究受体的本质性问题。前面介绍的研究受体的一些基本方法对于阐明受体的基本特征、作用机制以及物理化学性质等有很大的帮助，但对于阐明受体的分子结构等问题则显得无能为力，而分子生物学技术却有着强大的优势。 分子生物学技术在受体研究中的突出作用在于能够明确受体的一级结构，并可进一步阐明受体的结构与功能之间的相互关系，同时还能在基因水平是研究受体生理调节和病理变化的分子机制等。 受体识别，信号转导是跨膜信息传递的重要步骤。 位于细胞表面的膜蛋白受体能特异性识别配体并与之结合，被激活的受体将接受到外来信号，再经信号转导分子的介导，导致细胞内效应器的活性改变，最终引起细胞对外界信号产生反应，此即跨膜信息传递过程。在这个过程中，受体本身也参与了信号物质的放大。 随着分子生物学技术的发展，许多膜受体的一级结构得以阐明，并且发现信号转导方式依赖一定的受体的分子结构特征。因此，根据受体本身的分子结构及其偶联的效应体系的不同，可以将受体的跨膜信息传递机制大致分为以下几类。 1．配体与受体结合后改变离子通道的活性 以N-AchR为代表的离子通道型受体属于此类跨膜信息传递方式。 这类受体本身由配体结合部位和离子通道两部分构成。未与配体结合时，离子通道处于关闭状态，当配体与受体发生特异性结合后，可触发受体蛋白构象改变，使离子通道开放，阳离子或阴离子就可经通道内流引起细胞膜的去极化或超极化。 由于这类受体直接操纵离子通道的开和关，改变细胞膜的离子通透性，进而影响细胞的兴奋性，因此，它们大都介导快速的信号传递