支原体污染检测试剂盒(PCR法).docVIP

支原体污染检测试剂盒（PCR法） (PCR Mycoplasma Detection Kit) Cat number：YS012 Store at -20℃ for one year Expire date： For Research Use Only 一、 试剂盒说明 本试剂盒通过PCR法对细胞培养物、动物分泌物等多种生物材料进行支原体污染检测。常规培养法进行支原体检需要时间，本通过PCR扩增及电泳分析进行支原体只需小时，方便。试剂盒多对引物能特异性扩增多种支原体rRNA基因片段，一次就可以检测支原体M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，M. orale，M. salivarium，M. hominis，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等。原核生物的rRNA碱基序列非常保守，而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区如16S和23S间隔区，各种生物种间的碱基序列差别很大。这个间隔区的DNA序列及长度在支原体各个种间既有相对保守的部分，也有具有很大差异的部分。在编码16S和23S rRNA的DNA上设计一对引物，扩增编码16S和23S rRNA的DNA间隔区，然后在编码16S和23S rRNA的DNA间隔区的保守区上设计一条引物，在编码23S rRNA的DNA上设计一条引物进行套式PCR。特异性支原体DNA，灵敏度与特异性都很高。10×Taq Buffer（不含Mg2＋） 1.0 mL-20℃ MgCl2（25mM） 1.0 mL-20℃ Taq DNA Polymerase（5 U /μl）100 U -20℃ Myc F1 Primer (10μM) 50μL -20℃ Myc R1 Primer(10μM) 50μL -20℃ Myc F2 Primer(10μM) 50μL -20℃ Myc R2 Primer(10μM) 50μL -20℃ Control Template(1 ng/μl) 50μL -20℃ DNA溶解液 2 mL -20℃ ddH2O 5 mL -20℃ 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 离心机、微量移液器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、dNTPs(10mM)、琼脂糖、溴化乙锭等 四、使用注意事项 整个，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行，以避免交叉污染。收取待检样品（细胞生长至80％左右即可，细胞不用消化液消化细胞，可以使用细胞刮刮取细胞），ul（约1～3×105细胞数）至离心管，12000rpm离心5～10min；去上清，加入0ul DNA溶解液，充分悬浮沉淀物，沸水浴5min；样品使用前12000rpm离心5～10min，取上清4ul作为PCR反应模板-20℃保藏。样本有时也可以直接用污染液直接做PCR反应。 2.PCR反应 第一步PCR： 50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）： 1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入 10×Taq Buffer 5 μL dNTPs (10mM) 1 μL MgCl2 (25mM) 4 μL Myc F1 (10μM) 1 μL Myc R1 (10μM) 1 μL DNA样品 1~5 μL Taq DNA Polymerase 0.5 μL ddH2O up to 50 μL （3）．轻轻混匀，2000rpm离心20s； 4）．进行PCR扩增 PCR扩增条件： 94°C，； 94°C，30 sec；5°C，；72°C，1 min；3 Cycles； 72°C，10 min，50μL体系PCR反应（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）： 1）．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s； 2）．取灭过菌的0.2mL离心管，在冰上依次加入 10×Taq Buffer 5 μL dNTPs (10mM) 1 μL MgCl2 (25mM) 4 μL Myc F2 (10μM) 1 μL Myc R2 (1