消灭PCR非特异性扩增的黄金方法.docVIP

消灭PCR非特异性扩增的黄金方法?by 老谈 2014-07-17?解螺旋 　　 　　PCR技术作为实验室的入门级技术，却经常困扰各位实验大神们。虽然度过了初学者们少加漏加PCR体系的阶段，但很多奋战在实验室一线的小伙伴正遭遇着PCR非特异性扩增的尴尬事件。为了解决这个问题，有多少人曾经把退火温度从50试到70、重新合成过引物、换过模板、换过全新的电泳缓冲液，或者还带着满腔的愤怒捏碎过电泳胶？今天老谈来教教大家如何对非特异性扩增嗤之以鼻！ ——by老谈 　　给各位小伙伴脑补一下非特异性扩增，即进行PCR所扩增出来的条带不是所要的，引物与模板在非目的条带处有错配，导致延伸产物不是目的条带。例如引物二聚体，即引物在退火过程中产生了hairpin结构或其他二级结构，或者引物在模板的某些位置非特异性地结合，也同样会产生非特异性扩增。 　 　　我们都知道，PCR产物都是通过引物延伸产生的。当引物产生了二聚体或者非特异性扩增产物之后，引物本身就无法再延伸形成PCR产物了，这样的情况下，非特异性扩增产物越是多，那目的产物就越是少。如果在qPCR过程中，就会在熔解曲线中形成双峰。 　　 　　小伙伴们遇到这样的问题，首先想到的可能是加入DMSO来阻止引物二聚体形成，或者EDTA来调节体系的离子浓度。但是具体问题具体分析，我们不能病急乱投医，这里老谈给小伙伴们整理了解决方法，希望可以帮助大家快速、准确的搞定这个“小问题”。 １、引物设计的过程中要用Primer premier 5.0来验证一下二聚体； 2、 引物合成后，先做一次梯度PCR，检测最合适的退火温度，一般高退火温度可以提高引物对模板的特异性从而降低引物二聚体； 3、 降低Mg2+浓度，镁离子浓度高，会导致大量的非特异性扩增，但是没有镁离子的话，也会导致Taq酶的失活； 4、降低dNTP浓度，dNTP也是非特异性扩增的一个罪魁祸首，降低它的浓度，也能有效降低二聚体及其他非特异性扩增； 5、降低引物浓度，一般的PCR引物都是过量的，降低了引物浓度自然也能降低引物之间形成二级结构的可能性； 6、提高退火温度，这个道理很简单，引物的退火温度提高，引物间的二级结构形成可能性就会降低； 7、延长退火时间，这个也可以减弱引物间结合的可能性； 8、DMSO及甜菜碱，这些PCR促进剂，主要是用于CG含量高的模板上，降低DNA的二级结构的产生，但根据经验，加入DMSO之后需要同时提高一点退火温度来补平（qPCR不太适用）； 9、热启动法，通过95的高温热启动，高温解链，使得引物间的二级结构破坏，以此降低二聚体产生。 　　回复“PCR”还有更多常见问题解析等着大家，希望对各位小伙伴有所帮助。