2-GFP的基因克隆分析报告.pptVIP

溶液 S1 裂解液 S2 中和液 S3 洗涤液W(去蛋白) 洗脱液 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 2 mg/mL　溶菌酶 作用： 溶菌酶，水解细菌细胞壁 EDTA,鳌合金属离子使金属酶失活 葡萄糖，维持渗透压 注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块 0.2 mol/ L NaOH 1% SDS 作用：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的，加入S2，该系统pH值高达12.6，促使染色体DNA与质粒DNA的变性。要温和操作，避免基因组DNA断裂。该步骤可看到菌液逐渐变清亮。 注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次 5mol/L 乙酸钾 60 ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 作用：调pH值到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。该步骤会出现白色絮状沉淀。 注意：复性时间不宜过长 2、离心层析柱 PCR T连接 转化 筛选 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 琼脂糖凝胶电泳试剂说明 0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，迁移率为 溴酚蓝=300bp双链线状DNA 二甲苯胺蓝=4kbp双链线状DNA 组成： EDTA 甘油 ……………增大溶液密度 溴酚蓝…………指示剂 二甲苯胺蓝……指示剂 DL5000 DNA Marker Loading Buffer上样缓冲液 PCR T连接 转化 筛选 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 插入740bp DNA片段 重组质粒大小为: 3038bp+740bp=3778bp 酶切片段大小为 ? bp 酶切位点 琼脂糖凝胶电泳结果预期分析 酶切位点 PCR T连接 转化 筛选 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 蓝白T载体酶切位点图 PCR T连接 转化 筛选 附： 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 质粒DNA三种构型： 1.共价闭环超螺旋 2.线性 3.开环的双链环状 在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率： 共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA 1: DL5000 DNA marker 2~8: pEGFP-N1 PCR T连接 转化 筛选 附：琼脂糖凝胶电泳方法 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 1. 凝胶准备 ① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加0.5×TBE 200ml ； ② 盖上牛皮纸，用橡皮筋捆紧 ③ 微波炉加热n次，直至融解，1min/次，中高温（一般3~5次）； 2. 胶床准备 ① 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙； ② 将胶床放在调整好的水平台上； 铺胶：将冷却至60℃的凝胶加入20 ?l荧光染料(有 毒)倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm； PCR T连接 转化 筛选 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极； 向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的6×Loading Buffer，用加样器轻轻混匀； 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为5~10 μl ； 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80~120v，时间20～30分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带； 取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果。 PCR T连接 转化 筛选 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 胶浓度（％） 线性DNA分子大小（kb） 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶 PCR T连接 转化 筛选 五、重组DNA的鉴定（酶切） 鉴定 原理 利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性） 仪器 紫外分光光度计 操作步骤 1. 取2?l提取的质粒DNA，加入98?l蒸馏水， 混合均匀； 2. 用紫外分光光度计测定OD260 DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50 ?g/ml双链DNA或 40?g/ml单链DNA(或RNA) 或 20?g/ml寡核苷酸 DNA或RNA的纯度判定 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 附：DNA的定量