高锐—基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用详解.docVIP

兰州交通大学化学与生物工程学院 综合能力训练Ⅰ——文献综述 题目：基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用 作者：高锐 学号：201207724 指导教师：谢放 完成日期：2014-7-16 基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用 高锐 201207724 摘要：基因敲除技术在微生物代谢工程上的应用渐趋成熟，本文在此基础上先对基因敲除技术及代谢工程的相关概念做了简要介绍，然后以阻断细胞的代谢旁路和引入突变位点这两条途径来着重介绍基因敲除技术在微生物代谢工程上的具体应用，最后说明了基因敲除技术应用于微生物代谢工程的一些技术缺陷。旨在对应用于微生物代谢工程的基因敲除技术做一个概括而全面的介绍与描述以及未来的展望。 关键词：基因敲除技术 微生物代谢工程 1. 前言 基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术, 利用微生物体内的同源重组系统, 在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组, 从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路, 或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量, 从而达到微生物育种的目的[1]。 微生物种类繁多, 数量庞大, 是大自然提供的天然宝藏。随着科技的发展, 发酵工业与生物催化向人们提出了更高的要求, 进一步提高目的产物的产量、纯度及开发有价值新化合物等都是有待解决的问题, 因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改造, 以获得高产高效的工业菌株[2]。随着对微生物代谢机理认识的不断加深, 随着生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程的发展, 定向操纵遗传变化成为可能, 代谢工程应运而生。 代谢工程就是利用重组DNA及其他技术, 有目的地改变生物中已有的代谢和表达调控网络, 以更好地理解细胞的代谢途径, 并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。对于工业微生物育种来说,从野生出发菌株到高效生产菌株, 需要经过代谢分析—设计策略—遗传修饰—代谢分析这一流程, 不断的循环调整, 对宿主进行遗传修饰为其中的重要一环, 包括DNA shuffling, genome shuffling及基因敲除技术, 这些DNA重组手段可以快速改变分散在基因组不同位置上的一个或数个基因, 从而改变相应的细胞表型, 快速优化代谢途径, 极大地促进代谢工程的进一步发展和应用[3]。 2.1. 基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用 应用基因工程技术对微生物细胞内的代谢通量进行重新设计, 是获得高产高效的工业菌株的重要手段之一。利用基因敲除技术在微生物代谢工程方面的应用主要包括两种途径：一是通过阻断细胞的代谢旁路的方法来提高代谢产量；二是通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量而达到调节代谢流, 改进微生物代谢产物产量，从而达到优化代谢途径的目的。下面分别介绍这两种方法[4]。 2.1.1. 利用基因敲除技术阻断旁路代谢产物的产生 （一）提高维生素产量 维生素C是人体必需的一种维生素和抗氧化剂，2-酮基-L-古龙酸（2-KLG） 作为维生素C 的前体物质，它的生物合成一直受到人们重视[5]。人们采用欧文氏菌和棒状杆菌进行串联发酵产生2-KLG 时，菌株具有很高的2-酮基醛糖还原酶（2-KR）活力，2-KR 能够利用NADPH 或NADH 辅酶将工程菌代谢中重要的中间产物2，5-DKG 及终产物2-KLG 转化为副产物5-酮基-D-葡萄糖酸（5-KDG）和L-艾杜糖酸（L-IA），阻碍2-KLG 的发酵生产[6]。构建了基因敲除质粒利用同源重组的方法用体外突变失活的2-KR 基因替换基因组上正常的2-KR 基因，采用抗性标记进行初筛，并用四环素抗性菌体对萎蔫酸等脂类螯合剂高度敏感进行四环素抗性丢失的正向筛选[7]。构建葡萄糖一步发酵产生2-KLG 的基因工程菌，将为阻断旁路代谢，实现从葡萄糖一步发酵产生维生素c 前体2-酮基古龙酸（2-KLG）打下基础[8]。 （二）提高苏氨酸产量 L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，在食品、医药等方面有极其重要的用途。应用质粒pKD46 介导的Red 同源重组技术敲除大肠杆菌ITHR中L-苏氨酸合成的代谢旁路途径中编码高丝氨酸转酰基酶的metA 基因和编码苏氨酸脱氢酶的ilvA 基因，分别构建了单敲除突变菌和双敲除突变菌[9]。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065 分别转入这些突变株中，构建了L-苏氨酸基因工程菌，进行连续发酵培养，当metA 和ilvA 基因同时敲除，苏氨酸的产量达到13.6±1。14 g/L，增加了约1.45倍。证明同时阻断蛋氨酸和