DNA重组(限制性内切酶与DNA片段化)重点分析.ppt

第二章 DNA重组 1.天然DNA的种类 染色体DNA 病毒和噬菌体DNA 质粒DNA 线粒体和叶绿体DNA 天然DNA的提取 （自学） 2.限制性内切酶和DNA片段化 核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割和连接成为可能。这两种酶是基因工程赖以创立的重要的酶学基础。 限制性内切酶 一类能识别dsDNA分子内部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸酶 来源：主要从原核生物中分离纯化而来 II型核酸内切酶：2300种以上，可识别230种不同的DNA序列（1994年，美国，分子生物学百科全书） 这种大自然赋予基因工程学家的了不起的礼物是如何发现的呢 2.1 寄主控制的限制与修饰现象 大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在这一些功能性障碍。 如：目前尚未发现有任何一种既可感染假单胞菌又可感染大肠杆菌的噬菌体，且非寄主细菌的RNA聚合酶不能够识别“外源”噬菌体的启动子，即使噬菌体的吸附和转录能进行，也仍然存在这另一种功能障碍——即为寄主控制的限制和修饰现象 限制——修饰现象 产生这种现象的原因何在 限制——修饰体系 在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制； 而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。 2.2 分类 限制性核酸内切酶的类型 2.3 命名 2.4 基本特性 识别并切割双链DNA（环状或线状）分子中4－8bp的特定序列（回文序列） 切割产生的单链断裂部位在DNA分子上的分布通常并不彼此直接相对（粘性） 断裂形成的DNA片段，往往具有互补的单链延伸末端 2.5 内切酶识别序列的特征 长度：4－8bp 结构特征：双重旋转对称的回文结构 切割后产生的末端：粘性末端3-OH，5－P或平末端 结构 多为双重旋转对称的回文结构，产生的末端为平末端或粘性末端。 如： 粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。 平末端的DNA片段则不易于重新环化。 5’…G-C-T-G-OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3 ’…C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’ 5’…G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G …3’ 3’…C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C …5’ 识别序列出现频率 1/4n 4Nt=44=256 6Nt=46=4096 稀切酶（rare cutting enzymes） 在DNA分子中出现的几率低，故称之为稀切酶 识别序列：比较长；富含AT；富含GC 同裂酶(isoschizomer) 酶来源不同，但具有相同的识别序列（切割位点可相同，也可不同） 切割位点不同，是不同的酶 切割位点相同，是相同的酶，来自不同生物 同尾酶（isocaudamer） 来源各异，识别的靶序列也不相同，但切割后的DNA片段具有相同的黏性末端，这样的一组限制性内切酶称为同尾酶。 2.6 切割位点 DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸上磷酸二酯键断开的位置 偏爱位点 P42 切割位点两侧序列的核苷酸组成亦与切割效率有关，即某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割 2.7 反应系统 底物：纯，线性，有保护序列 酶：样品，识别序列的密度，容积活性 反应缓冲液 反应条件 大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件： 2) DNA的甲基化程度 核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中，质粒DNA是来源于甲基化酶缺陷型的大肠杆菌菌株。 这样制备的质粒DNA，其中的内切酶识别序列没有甲基化，不受限制。 2 酶活单位 1个酶活单位：在最适反应条件下，在20?l反应液中反应1小时，使1?g ? DNA（标准DNA）完全消化所需的酶活性称为1个单位。（教材P43） 2.9.1 单酶切法 环状DNA分子 产生与识别序列数（n）相同的DNA片段 且DNA片段的两末端相同 线形DNA分子 产生n+1的DNA片段 2.9.2 双酶切法 环状DNA分子完全酶切 DNA片段数为两种限制酶识别序列之和 n1+n2 线状DNA分子完全酶切