胶体金生产工艺配方原则精要.pptVIP

胶体金诊断试剂工艺配方原则 内 容 硝酸纤维膜生产工艺图 孔径定义的问题 孔径对侧向层析速度的影响 不同种类膜的 IgG结合能力 不同种类膜的 BSA结合能力 为什么蛋白会结合到膜上? 结合力是什么? 静电 疏水力 这两种结合力的效应是什么? 使蛋白从溶液中分离出来 长久结合作用 静电作用力 静电作用力是正负电荷相互吸引产生的作用力 疏水作用力 疏水作用力又称为疏水键。它是由侧链的疏水基团相互接近. 而形成的一种作用力。对维持分子的三、四级结构起着重要的作用。每一个蛋白质都具有疏水基团和亲水基团。 蛋白质疏水性状和亲水性状 当蛋白质溶解在溶剂中时，蛋白质处于非常稳定的状态，此时蛋白质的亲水基团展开在外，疏水基团收缩在内，亲水基团和水分子接触，保证了溶解性的状态；当蛋白质沉淀出来时，疏水基团展开，亲水基团收缩，此时为疏水状态，也呈现不稳定的固体状态，疏水基团和其他固体物的疏水基团通过疏水作用力结合，达到固定的目的。 蛋白结合到固相材料上 蛋白结合到固相材料上是一个多步骤过程 取决于 蛋白溶液扩散到固相表面 蛋白从溶液中分离出来 蛋白吸附到固相上 蛋白重排到最低能态 吸附过程 多位点结合 影响蛋白结合的因素 蛋白缓冲液 使用的膜 蛋白自身 应用体系 蛋白缓冲液 没有通用的缓冲液，不同的系统必须分别优化。 作用：提供适合的PH, 改善亲水性, 增溶性,提高稳定性 定律: “蛋白在缓冲液中越不稳定，蛋白结合力越强” 缓冲液的优化 离子强度 对于蛋白从溶液中脱离出来很重要，少量的离子强度，蛋白难以从溶液中脱离沉淀出来，过量的的离子强度，溶液配制中就已会出现沉淀。 pH 蛋白在等电点最不稳定 沉淀剂 通常用醇降低蛋白的稳定性，也可润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。 盐 通常不会影响 对某些蛋白，两性离子的盐类有助于蛋白结合 减少信号强度，消假阳 糖：对包被蛋白的稳定性有重要作用，减缓老化速度，也可以增加亲水力。 惰性蛋白：对消除假阳有重要作用 表面活性剂：增加亲水力，也可增色。 缓冲液的基本成分 各种缓冲系: Tris-HCl, PB, CB等 盐类：NaCl 糖：蔗糖，海藻糖等 表面活性剂：Tween20，Triton x-100等 惰性蛋白：Casein等 防腐剂 ：叠氮钠，卡松等 推荐的起始缓冲液 10mM Phosphate pH 7.0 3% Ethanol “潜水艇” 效应 表面活性剂处理过的膜在使用时的常见问题 因为使用的表面活性剂是水溶性的 喷膜时这些表面活性剂被“冲走”了 反应动力学 流速增加,反应速率减低 流速增加,检测时间缩短 流速增加,灵敏度降低 流速增加,试剂用量增加 流速增加,背景降低 距离增加,流速降低 孔径增加,蛋白结合量减少 二、和金子垫相关的配方和原理 和金子垫相关的工艺和配方有： 1）标记工艺； 2）金标稀释液 3）金垫处理液 标记工艺 胶体金：一般指金的水溶液，又称金溶胶。 ---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。 其中分散的金颗粒直径一般在1~100nm之间，为负电荷分布。 高质量结合物 单个分散的颗粒 圆形颗粒 很少聚集 这样得到的胶体稳定性 和重复性好 胶体金的生产 胶体金的形成是还原HAuCl4. HAuCL4 + e- Au0 还原剂越强，得到的金颗粒越小 生产 40nm诊断用金颗粒一般用柠檬酸三钠 胶体金颗粒的形成 胶体金的生产 2种重要步骤 直接形成 分步形成 大多数人用分步形成 比较容易控制颗粒大小，CV也比较小 能够生产出大颗粒胶体金 颗粒大小对胶体的影响 蛋白标记原理 蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，依靠静电引力或疏水力或共价键，被牢固地吸附于胶体金颗粒表。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使该胶联溶液较为稳定。 要点 蛋白的预处理 使用低浓度和正确的pH值，确保最小的聚集 合适的蛋白量（可通过盐滴定进行评价） 搅拌速度、容器的洁净程度、离心的速度 盐滴定 盐滴定不能衡量蛋白单层的形成 盐滴定只能代表盐溶液中多少量的蛋白可以使胶体金稳定 pH和时间都会有影响 蛋白邦定作用力 电荷作用力（静电作用力） 疏水力 共价键 金标稀释液 合适的离子种类和强度，0.2M左右，常用有磷酸盐等。 大分子物质作为胶体金干燥后均匀散布的骨架，常用大分子物质如PEG4000，PEG20000，PVP 。 小分子物质对蛋白活性保护，?蛋白储存常用的甘油、蔗糖、海藻糖、各类低聚糖等，对产品的储存稳定性有帮助