细胞培养及建立泡沫细胞模型.docVIP

2)实验手段 (1)细胞培养及建立泡沫细胞模型 将THP-1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于370C, 5} CO:培 养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，倍增时间 大约在26 h后。细胞浓度控制在106/mL，每两天换液一次，每四天传代一次。细胞复苏 后，传至3 }= 5代后方可用于建模。 (2)建立巨噬细胞模型 取对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为106/mL，接种于6孔培 养板，每孔2 mL。正常组在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养。模型组先 置于含160 nmol/L PMA的RPMI 1640基础培养液中培养72 h，贴壁后轻轻吸去上清液， PBS洗3遍，更换10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，即得巨噬细胞。巨噬细胞的鉴 定己在发表文献中完成。 (3)建立巨噬源性泡沫细胞模型 将获得的巨噬细胞更换含3%胎牛血清的RPMI 1640培养液，并加入终浓度为80 mg/L 的Ox-LDL，共同孵育48 h，油红。染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得泡沫 细胞模型，此过程即为泡沫化。 (4)针对CaSR的si RNA的构建及转染 根据公认的si RNA设计原则(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)设计针对CaSR的3 条siRNA，选用验证后效果最好的一条。同时合成阳性对照和阴性对照。转染试剂选用 Invitrogen公司生产的LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagento siRNA目标序列的选取原则: 工从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找‘`AA’二连序列，并记下其3’端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。注意:GC含量在4_5 070-_5 _5%左右的siRNA要比那 些GC含量偏高的更为有效;在设计siRNA时不要针对_5’和3’端的非编码区 Cuntranslated regions UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响 siRNA的效果。 1)细胞总RNA提取:按Trizol试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下:在细胞 中加入冰预冷的Trizol试剂，室温静置_5 min;加200 } 1氯仿，充分摇匀1_5sec，室温静 置2-3 min ; 4 0C，12000rpm离心1 _5 min，取上层无色水相层转移至新EP管;加等体积 异丙醇，室温静置l Omin } 4 0C } 12000rpm离心l Omin，管壁底处可见乳白色沉淀，即 为RNA;弃上清，加7 _5%乙醇1 ml } 4 0C } 7_500rpm离心_5 min，洗涤二次;弃上层乙 醇，无菌环境风干RNA沉淀。用20州DEPC处理的双蒸馏水(ddH20)溶解RNA沉淀， -80 0C备用;取4川总RNA加至200川灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其ODZ}o和 ODZSo，计算ODZ}o/ODZSo。样品总RNA ug枢1) = OD26ox40x稀释倍数(50 ) /1000 o OD26o /ODZgo在1.8-2.0之间为样品较纯。 2)反转录反应:在20川反应体积中进行，成分如下:总RNA tug (5川)，随机引 物1 } 1 } DEPC处理的ddH20 4.5}1} 70 0C冰浴l Omin;加10林1逆转录反应液(l Oxbuffer 2}1 MgCL24}1} dNTP2}1} inhibitor0.5}1，逆转录酶1}1)} 420C冰浴60min } 99 0C冰浴_5 min -20 0C保存备用。 3)引物扩增设计:根据Genebank序列，设计各个引物序列并合成。 4)实时定量PCR实验方法:使用宝生物工程(大连)有限公司的SYRB. Premix Ex TaqTM和Light Cycler PCR扩增仪(Roche)进行荧光扩增;求出CT值。 (6)激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定THP-1细胞内游离钙的变化 取6孔板进行THP-1细胞培养，事先在6孔板中加入盖玻片。取6孔培养板中的盖玻 片，D一Hanks液冲洗2遍，用1OO}L的钙离子探针Fluo-3 /AM与F-127混合工作液(10 }mol/L Fluo-3 /AM, 0.02070 F-127)滴于盖玻片上，370C避光40 min } D一Hanks液再次冲洗玻片3 遍，洗去多余染料，保留少许D-Hanks液平衡细胞10