精液的冷冻保存精要.pptVIP

精液的冷冻保存 主讲人：朱秀生 一、实验目的：练习公猪、公牛精液冷冻保存的方法，要求学会： 1、稀释液和解冻液的配制方法； 2、精液的稀释、降温、平衡及制冻的技术； 3、冷冻精液的解冻技术。 二、实验材料：公猪精液、公牛精液、新鲜牛奶、新鲜鸡蛋、葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠（二水）、蒸馏水、量筒、玻璃注射器、烧杯、三角烧瓶、滴管、冰壶、保温杯或小液氮罐或泡沫盒、冰、液氮、0.25mL塑料吸管、冷冻架、温度计、水盆、纱布、棉花，抹镜纸、75%精棉球、镊子、捞筛、液氮罐、载玻片、小玻棒、石腊油、显微镜、水浴锅、铝锅、电炉、标记笔等。 精液冷冻保存原理 精子在超低温下，其代谢活动几乎停止（完全被抑制），使其在静止状态下保存下来，一旦升温又能复苏而不失去受精能力。其理论依据是玻璃化假说和甘油保护学说。 （1）玻璃化假说 物质的存在形式有气态、液态和固态，其中固态又分为结晶态和玻璃态。在不同的温度条件下，这两种形式可以相互转化。 A.结晶态 当精液的温度由冰点（0℃）缓慢降到-60℃左右时，精液中的水分由液态变成固态，冰晶颗粒大而均匀，叫做结晶态或冰晶化。对细胞内的细胞器构成巨大的破坏作用，因而，把这一温度区称为有害温区。缓慢降温形成冰晶化是造成精子死亡的主要原因。 B.玻璃态 但在特定冷冻剂参与下，精液由低温骤然降到-60℃度以下，精液变成固态时，冰晶颗粒细小而均匀，叫做玻璃态（化）。不会对细胞器造成破坏，从而达到长期保存的目的。 经试验证明，在0～60℃是冰晶形成的温度区域，叫做危险温度区。而且在逐渐降温的条件下才能形成。降温越慢，冰晶形成越大，尤以-15～25℃为甚。玻璃化必须在-60～-250℃的低温区域内，经快速降温，迅速越过冰晶化而形成。 抗冻剂的抗冻原理 甘油保护学说 快速降温可使精液跨越结晶态进入玻璃态，但急剧降温会造成精子冷休克。研究表明，向稀释液中添加甘油，不但可增强精子的抗冻能力，而且又可防止冰晶化和精子冷休克。 甘油又名丙三醇，分子式CH2（OH）－CH2（OH）－CH2（OH），为高热能脂肪家族，其3个羟基（OH）为亲水基团，可与精液中的水结合，限制和干扰水分子的晶格排列，而产生冰晶；其烃链为疏水基团，朝向精子，可阻止精子的内外水分相互渗透，从而使精子保护在玻璃化膜中。 但是，甘油浓度高时，对精子有危害作用，应掌握甘油的用量。一般牛冷冻精液中甘油通常加入5％～7％。 除甘油外，其他多羟化合物如二甲基亚砜(DMSO)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、糖类等都具有抗冻作用。 冷冻保存精液剂型 塑料细管型 颗粒型? 安瓿型 目前已很少采用。 精液冷冻之后，因有半数以上的精子遭受冻害而死亡，故精液稀释液倍数，应按照解冻后需保证每头份精液中要求应含有直线前进运动的有效精子数来确定。为此，实际上应根据原精液呈直线前进运动的有效精子总数和冷冻精液解冻后预测精子活力来决定精液的稀释倍数，其计算公式如下： ? ??X=Y·M·V/Z ? ??式中：X为冷冻精液稀释倍数? ??Y为每ml原精液中呈直线前进运动总精子数? ??M为冷冻精液解冻后预测精子活力? ??Z为每头份冷冻精液要求最低应含有直线前进运动精子数? ??V为冷冻精液剂型容量? ??由于细管型冷冻精液的容量为0.25或0.5ml，因此稀释倍数较低。而颗粒型冷冻精液前后需经两次稀释(冷冻稀释和解冻稀释)，每头份剂量为1.5～2.0ml，因此稀释倍数也就较高。 例如根据我国牛冷冻精液国家标准规定，细管型冷冻精液容量为0.25ml，直线前进运动精子数不低于1000万个；颗粒型冷冻精液容量为0.1ml，直线前进运动精子数不低于1200万个；解冻后的精子活率均不得低于0.3。因此，如0.25ml细管型冷冻精液的稀释倍数(X)应代入上述公式为： ? ??X=直线前进运动精子数/ml*预测精子活率（≥0.3）*0.25ml/1000万 三、方法与步骤 （一）公猪精液的冷冻保存方法 本次实验为精液的颗粒冷冻，制冻采用吊盆法。在液氮中（－196℃）保存。液氮是一种无色、无味、无臭、无毒的超低温液体，标准温度为－195.8℃。在气化时，每升可以从周围夺取200千焦(48千卡)热量，气化后温度上升至18℃时，体积膨胀680倍。此外，液氮为不活泼气体，其渗透性很弱，本身无杀菌能力，故精子、细菌、微生物等仍能在其中生存，只是－196℃的超低温可使多数细菌、病毒停止繁殖。? 1、稀释液及解冻液的配制 （1）稀释液的配制 ①用天秤分别称取葡萄糖4g、蔗糖1.2g，放入干净的烧杯中，然后加入蒸馏水57mL。搅拌混合均匀，加盖，置于水浴锅中隔水煮沸消毒10min，取出冷却备用。 ②将新