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常规操作：冷启动，在冰上把反应物混合后，设计最佳程序，直接进行。 热启动操作：先把引物和模板混合并加热到高于非特异性结合温度，加入聚合酶，启动PCR。 降序操作： PCR过程优化的最佳选择。前两个扩增循环的复性温度比富含GC引物与模板完全配对的熔链温度高3℃。随后的循环中，复性温度逐渐降低1℃。总有一个温度点是特异性扩增的温度。 用于兼并引物、模板DNA序列复杂和进行多重PCR。 降低非特异性扩增。 5.PCR操作方式 目标基因扩增 反转录PCR（Reverse Transcription PCR, RT?PCR）:以mRNA为起始材料，通过反转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成DNA片段。 应用：克隆基因的末端序列、表达的功能区段 检测基因表达和诊断遗传病和感染的病毒等 二、反转录PCR技术 目标基因扩增 第一步:反转录反应 第二步:PCR扩增反应 1.RT－PCR原理与过程 目标基因扩增 2. RT反应体系的组成 目标基因扩增 成分 浓度 用量 mRNA 1pg～100ng 缓冲液 10× 2 μl 4种dNTPs混合液 20 mmol/L 1 μl 引物 5～20 pmol/L 1 μl RNase 抑制剂 20 U 1 μl MgCl2 50 mmol/L 1 μl 反转录酶 100～200 U 1 μl H2O 13 μl 总体积 20 μl 3. 反转录酶特性与选择 目标基因扩增 酶 温度℃ 模板 聚合活性 RNase H 产物 AMV 41-45 ssRNA, ssDNA 5→3 强 短 MMLV 37 ssRNA, ssDNA 5→3 弱或无 长 （1）样品变性。75℃变性RNA 5分钟，冰上冷却。 （2）反转录。加入其他成分，混合。在42℃或37℃下，合成cDNA第一链，一般1小时。 （3）终止反应。95℃加热5分钟，使反转录酶失活。 设置相关的正负对照，便于监测反应过程和分析反应结果。 反转录之后，对产物稀释至一定倍数，然后作为模板，建立PCR反应体系，进行PCR扩增。 4.RT反应操作 目标基因扩增 溶菌酶和SDS处理:破裂细胞后，释放出内容物。 碱变性:蛋白质、细菌染色体和质粒都发生变性。蛋白质、细胞壁碎片和染色体DNA相互缠绕形成大型复合物，被SDS包裹。 酸中和：加入乙酸钾，使碱性溶液至中性，染色体分子巨大，无法复性，质粒很快复性,进入上清液SDS包裹蛋白质、染色体及细胞碎片被沉淀下来。离心:除去蛋白质、染色体DNA及细胞碎片等沉淀，质粒保留在上清，最后用乙醇或异丙醇沉淀。 质粒载体的分离与纯化原理 1. SDS碱裂解制备提取质粒的原理 基因的体外重组 去污剂：Triton X100 煮沸加热：使细胞壁裂解，同时使蛋白质、核酸等变性沉淀。 降低温度：冰浴迅速降温，质粒得以复性，其他生物大分子不能有效复性. 离心:除去杂质，收集质粒。 加热裂解制备提取质粒的原理: 基因的体外重组 质粒大小：大于15 kb，温和的SDS碱法提取，操作过程也要尽量轻柔，避免质粒被机械剪切而断裂。小于10 kb的质粒可用剧烈的加热裂解法提取。 碱或加热处理时间：对提取质粒的质量影响很大，时间延长会使质粒不可逆变性，应注意避免。 除去RNA：由于含有大量的RNA，要用RNase A处理。 RNase A可在第一步加入，节省时间。 溶菌酶：小量提取，不加溶菌酶。大量提取时添加7％ 溶菌酶，并给予一定时间处理。 注意事项 基因的体外重组 质粒的电泳检查： 2～3带：2～3种螺旋构型质粒的电泳速率不同 最亮带：负超螺旋质粒 中间带：缺口开环质粒 滞后带：两条链都断裂的线性质粒 出现两条带，开环质粒带很弱，是正常的。 基因的体外重组 质粒不能酶切：可在沉淀质粒之前，用苯酚或苯酚、氯仿抽提，提高质粒的质量。 质粒的纯化：现在多用离子交换、吸附、凝胶过滤等原理纯化，有很多商品化的试剂盒。 转化:某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，使其基因型和表型发生相应变化的现象. 转染:除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程. 转导:用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程. 遗传转化与筛选鉴定 一、转化 1. 概念 遗传转化操作：将重组DNA分子导入受体细胞过程。 物理方法：热击诱导，电穿孔法，基因枪 化学方法：PEG介导，脂质体转染 接合转移：细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。 噬菌体转染: λ-DNA体外包装成为噬菌体颗粒,转染细菌。 2. 转化方法 大肠杆菌热击诱导转化：制备感受态细胞，加入DNA，热击42°C 90s，冷却，涂平板 电转化：电转仪，控制高压放电。受体细胞制备（减少细胞壁的形成）。酵母电转化：YPAD培养基(50 ml)培养酵