majun基因工程基因文库的构建目的基因的获取教程分析.ppt

优点：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA PCR合成法 该方法是构建cDNA文库的新策略，目前已经广泛使用。 PCR合成法是以cDNA第一链为模版，利用一组引物，通过PCR扩增的方式合成第二链，并且能够获得多拷贝的双链cDNA模版。 由于PCR的高灵敏度，该方法能利用非常有限的模版构建cDNA文库，特别适合低拷贝的mRNA的克隆。 可以利用总RNA直接合成cDNA第一链作为模版，不同纯化mRNA，并且通过PCR的方式合成cDNA第二链，然后直接进行PCR过程。 方便、快捷、样本损失小，高效。 Poly（AAAAAA） 5` Oligo（TTTTTT） Poly（AAAAAA） 5` Oligo（TTTTTT） 3` cDNA第一链的合成 RNA降解 Oligo（TTTTTT） 3` cDNA第二链的合成 引物1 5` Oligo（TTTTTT） 3` cDNA第二链 5` PCR过程 常用的PCR合成法 Poly（AAAAAA） 5` Oligo（TTTTTT） Poly（AAAAAA） 5` Oligo（TTTTTT） 3` cDNA第一链的合成 RNA降解 Oligo（TTTTTT） cDNA第二链的合成 3`同聚物CCCCC Oligo（TTTTTT） cDNA第二链 PCR过程 5`引物GGGGG 3`同聚物CCCCC 加同聚物接头的PCR合成法 四、双链cDNA末端的处理 由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的。 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 1同聚物加尾法：cDNA和载体末端添加同聚物 质粒载体 酶切 CTGAC G G ACGTC 加同聚物尾 CTGACGGGGG G G GGGGGACGTC 双链cDNA 加同聚物尾 CCCCC CCCCC 连接 转化 2接头法：在cDNA末端添加含有限制性内切酶位点的接头 质粒载体 酶切 CTGAC G G ACGTC 双链cDNA 加接头 GACTG CTGAC ACGTC TGCAG 连接 酶切 C GACTG TGCAG C 转化 3衔接头法：特殊的接头，一端可以和cDNA平末端连接，另一端可以直接和酶切后的载体粘末端结合。 质粒载体 酶切 CTGAC G G ACGTC 双链cDNA 加接头 连接 TCGAC AGCTGACTG TGCAGTCGC CAGCG 转化 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 基因组DNA文库的优点 基因组DNA文库包括了基因组的全部信息，如间隔序列、非转录区段序列等，能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 CDNA文库的优点 cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 cDNA文库的筛选比较简单易行。 cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。 基因组文库和cDNA文库的扩增和保存 保存-80度 转印 NC膜 噬菌体 1 2 3 混合菌液 混合菌落 第七章 目的基因的获取 生物科学与技术学院 基因工程或DNA重组技术的目的是从生物体基因组中分离克隆目的基因。 目的基因获得之后，通过基因工程要完成： 1、确定其表达调控机制和生物学功能 2、建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 3、将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。 目的基因用途很广，主要有以下几个方面： 研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。 与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。 研究生物种系进化与相关同源性。 应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。 建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。 目的基因的获取 化学合成法 基因组DNA文库 cDNA文库 聚合酶链式反应 染色体步移 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大