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RNA干扰 目录 概 念 发展简史 发展简史 发展简史 机制原理 研究的一般路线 * * 概念 发展简史 机制原理 问题与展望 应用 制备方法 RNAi(RNA interference ，RNA干扰)：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉默（gene silence)的现象。因此，又称为knockdown。 它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。 90年代初，Rich Jorgensen 设想，在矮牵牛中过表达花色素基因，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，花的颜色变为白色，当时称共抑制（cosuppression)。 1994年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制 (quelling)。 1995年Guo和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样的结果——特异性阻断该基因的表达，从而正式表明RNA干扰现象的存在。 发展历程 1998年，Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 RNAi现象普遍存在动植物体内。发现植物中的21-25nt的RNA分子诱导PTGS（post-transciption gene silence，转录后基因沉默）。 2001年，Emily等在果蝇中确定了降解dsRNA的关键酶，并命名为Dicer，此酶属于RNaseIII家族，在进化上保守。 发展历程 2002年，Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。 2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。 发展历程 关于基因沉默 转基因沉默分为转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS)两种： （1）TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因沉默。 （2）PTGS 是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。 细胞自然存在二种干扰RNA： 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）：19-25nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导mRNA降解。 microRNA(miRNA) ：22nt，呈短发夹结构（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前体酶解而成，抑制mRNA翻译。 关于核酸内切酶Dicer 在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3端突出的小分子RNA片段，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。 SiRNA的分类 寡核苷酸SiRNA：人工合成、体外转录 特点：易于设计、合成昂贵、瞬时表达 吗啡啉核苷SiRNA：人工合成RNA类似物。 特点：结合力强，不易降解，效率高 载体表达型SiRNA（细菌质粒、病毒载体）：基于表达载体在细胞内表达。 特点：稳定表达、可大量扩增，转染效率低，操作繁杂 RNAi 的基本过程 siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量； RISC（RNA-induced silencing complex）形成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式； 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA，无需或消耗少量ATP。 确定目的基