毒理学实验微核试验.pptVIP

实验一微核试验实验目的学习小鼠骨髓微核试验原理掌握微核试验的制片方法学习掌握微核的观察计数掌握微核试验的结果分析评价4123实验原理微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。微核试验(Micronucleustest，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。微核可出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分支相区别，由于红细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此，通常计数PCE细胞中的微核数。实验原理器材与试剂器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、晾片架、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、1ml注射器及针头、载玻片及推片、带油镜头显微镜、细胞计数器。器材与试剂试剂甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1)、pH6.8的磷酸盐缓冲液。器材与试剂阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C123试验动物及处理观察计数骨髓液的制备和涂片操作步骤操作步骤1、试验动物及处理(1)动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18~20g，7~12周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。操作步骤(2)染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与人体接触化学毒物相同的途径。操作步骤(3)染毒次数及取样时间：采用两次染毒的方式，即第一次染毒24小时后，进行第二次染毒，6小时后取样。操作步骤(4)剂量选择：受试物应至少设三个剂量组，最高剂量组原则上为不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品1/5、1/10、1/20LD50剂量。阳性对照组可用环磷酰胺(50~100mg/kg)或丝裂霉素C(10mg/kg)腹腔注射1次或2次。阴性对照组使用等体积的溶剂。2、骨髓液的制备和涂片试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨(或股骨），擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺。用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片。操作步骤操作步骤3、固定将推好晾干的骨髓片放入染色缸中、用甲醇溶液固定15min取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。操作步骤4、染色将固定晾干后的涂片、用新鲜配制的Giemsa应用液(Giemsa储备液1份加PH6.8的磷酸盐缓冲液9份)染色10~15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。操作步骤5、观察计数先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀．染色较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。Illustrationofabinuclearhumanlymphocytecontainingamicronucleus(arrow).Nuclearmaterialappearsinyellow,cytoplasminred.Acridin-Orangestaining,fluorescencemicroscopy,enlargement1000fold结果与分析本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；正常的PCE/NCE比值约为l(正常范围为0.6~1.2)。如比值＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。结果与分析微核试验所获数据资料的频数分布尚无定论，多种统计学方法(如泊松分布、二项分布、χ2检验等)均有人用于试验结果的统计分析。该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。(1)坐姿：端坐于实验台前，将显微镜直立放置，以免镜油流掉影响观察或造成污染。(2)识别油镜头：油镜头上一般有“×100”，“Oil”等标记。(3)对光：低倍镜对光，取得最大亮度。(4)滴加香柏油：将标本滴加香柏油一滴，油镜检查。(5)调焦距：将油镜镜头移至中央对准标本，从侧