膜片钳技术及其应用实例分析报告.pptVIP

2、电极内液： CsMeSO3，CsF ，EGTA ，Mg2ATP ，Phosphocreatine ，HEPES，调pH值至7.4 ， 电极外液： NaCl , KCl, MgCl2, NaHCO3 , NaH2PO4 , D-glucose , HEPES , CaCl2 ，用NaOH调pH至7.4 3、全细胞膜片钳 电压门控性钙离子通道的动力学研究 激活（Activation）：用激活曲线反映通道开启的速度和难易程度 Boltzmann方程拟和：gCa/ gCa max={1+exp[-(Vm-V?1/2)/ K?]}-1（gCa max 峰电导的最大值，V?1/2半数激活电压，K?激活斜率因子） 稳态失活（Steady-state Inactivation）反映通道失活数目的电压依赖性，用失活曲线表示 ICa/ICa max={1+exp[(V-Vi1/2)/ Ki]}-1（ICa max 峰钙电流的最大值，V预刺激电压，Vi1/2半数失活电压，Ki失活斜率因子） 复活（Recovery）用复活时间常数曲线表示 单幂指数方程拟和 ICa=Aexp(-t/?r)+C（A起始时间，t为时间，?r为复活时间常数，C常数） 小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征 * 配体门控通道电流：GABA电流的记录 DRG神经元GABA激活电流 Bic对IGABA电流有明显抑制作用 Iso使DRG神经元IGABA电流幅值增大 * 膜片钳技术及其应用实例 王 强 * 南京医科大学公共卫生学院神经毒理实验室 内容提要 离子通道 膜片钳技术（Patch Clamp Technique） 应用实例 * 被引用次数13325 一、离子通道 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科—电生理学（electrophysiology）。 膜片钳技术已成为研究离子通道的“金标准”。 * 电压门控性离子通道：膜上通道蛋白的带点集团在膜电位改变时，在电场的作用下，重新分布导致通道的关闭，同时有电荷移动，称为门控电流。 配体门控离子通道：神经递质（如乙酰胆碱）、激素等与通道蛋白上的特定位点结合，引起蛋白构象的改变，导致通道的打开。 机械门控离子通道：机械牵拉 其他 * 二、膜片钳技术 1976年 德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann在青蛙肌细胞上记录记录到ACh激活的单通道离子电流 1980年 Sigworth等用负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声 1981年 Hamill和Neher等引进了膜片游离技术和全细胞记录技术 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。 * Neher(1944-) Sakmann(1942-) 共获1991年诺贝尔奖 * 膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞，形成吉欧姆(GΩ)阻抗，使得与电极尖端开口处相接的细胞膜的膜片与周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流(pA级)进行监测记录的方法。 膜片钳技术的记录模式 * 全细胞膜片钳等效电流图 * * 膜片钳实验系统组成 放大器 转换器 刺激器 防震台 显微镜 微操纵器 探头 屏蔽网 监视器 EPC 10 Plus膜片钳放大器 武汉华中科大仪博 PC2C 三、应用实例 生精细胞 背根神经节神经元 皮层神经元 * 神经毒理研究室是现代毒理学教育部重点实验室和江苏省应用毒理重点实验室的组成部分，在上世纪八九十年代就开始组建膜片钳实验室，属国内较早一批开展此工作的课题组，二十年来，在导师肖杭教授领导、全体研究生的共同努力下，现在这门技术已经成熟稳定，并得到国际国内同行的认可。 * 精子获能信号转导模式图 应用实例一：生精细胞离子通道学研究 小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流 1、急性分离生精细胞 机械分离法分离小鼠睾丸组织得到的细胞 单酶消化法分离小鼠睾丸组织得到的细胞 小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流 小鼠生精细胞T型Ca2+电流密度曲线图 Ca2+通道在-60mV时激活，电流在-30mV时达到最大值，翻转电位约为48mV，峰电流密度6.56±1.08pA·pF-1。(n=11) ?失活曲线： 分析细胞膜电位的变化引起失活离子通道数的变化。半数失活电(-60.79?0.24)mV，斜率因子(4.71?0.22)mV，