表观遗传学之miRNA简介教案分析.pptVIP

MicroRNA 报 告 内 容 MicroRNA表达检测 MicroRNA功能学实验 MicroRNA报告基因实验 MicroRNA表达 MicroRNA简介 1. MicroRNA简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度约19~24nt的非编码单链RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因的3’UTR区部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而起到转录后调控靶基因的表达。 miRNA的合成途径 2. MicroRNA表达检测 定量检测组织或细胞样本中的miRNA是功能研究的第一步，主要通过荧光实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)、Northern Blotting方法检测miRNA的表达情况。 2.1 实时定量PCR(Quantitative real-time PCR) TaqMan探针法 SYBR Green 法 实验流程 特异的茎环逆转录引物及定量PCR引物的设计及合成 样品总RNA的提取 RNA定量及质量检测(1.9OD2.0) 使用茎环引物进行逆转录(RNA:最少1ug/体系) qRT-PCR检测分析，得到原始数据。 2.2 Northern Blotting 服务流程： 目的microRNA杂交探针的设计及合成 总RNA的抽提 小RNA的分离富集(5s以下RNA) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜（可反复使用） microRNA的Northern Blotting分析 （每个杂交管只能杂一个miRNA） 出具杂交图片 microRNA的杂交图片，内参：Ｕ6snRNA。 3. MicroRNA报告基因实验 采用microRNA报告基因试验寻找microRNA的靶基因，分为初筛及突变试验。 初筛：将候选靶基因的3′UTR区构建至荧光素酶报告基因下游，然后将之与目的microRNA前体或mimic共转染293T或Hela细胞系，然后通过比较处理组与对照组的荧光素酶活性。 突变试验：构建已突变靶位点的荧光素酶报告基因载体，然后继续使用荧光素酶报告基因试验验证初筛的结果。 pGL3载体图谱 5’UTR 3’UTR 载体构建过程 荧光素酶报告基因 5’UTR 3’UTR 靶基因 靶位点 PCR 双酶切-连接 5’UTR 3’UTR 靶位点 荧光素酶报告基因+靶基因3’UTR XbaⅠ SacⅠ 荧光素酶报告基因+靶基因3’UTR miRNA载体 苷酸 转染细胞系 对照寡核苷酸 转染细胞系 荧光 荧光 荧光 靶基因 非靶基因 初筛： 荧光素酶报告基因+靶位点突变的靶基因3’UTR miRNA载体 苷酸 转染细胞系 对照寡核苷酸 转染细胞系 荧光 荧光 靶基因 突变实验： HAP2b靶位点 5’ AGGCAAATCATCTTTGGCTCA 3’ miR169d (21nt) 3’GCCGUUCAGUAGGAACCGAGU 5’ 突变后： 5’AGGGGTACCAGCTTTGACTCG 3’ kpnⅠ 红色为本身错配碱基 蓝色为突变点，突变后miRNA不切割靶基因，不影响靶基因的表达。 突变点设计实例： 重叠区域KpnⅠ酶切位点 5’ 3’ SacⅠ KpnⅠ Fw1 Rv1 Fw2 Rv2 ①酶切：KpnⅠ ②连接 含突变点的靶基因3’UTR区 XbaⅠ KpnⅠ 5’ 5’ 5’ 3’