第二章基因工程重组DNA导入受体细胞分析.ppt

脂质体介导转染的机制 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用,将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体,其中一小部分DNA能从包涵体内释放,并进入细胞质中,再进一步进入核内转录、表达。 利用脂质体介导法将外源DNA导入哺乳动物细胞具有实用潜力。 由于脂质体具有无毒、无免疫原性的特点，不仅可用于体外受体细胞的基因转化，而且可以在动物体内将基因转入肝细胞、血管内皮细胞等靶细胞或靶组织、靶器官位点，实现瞬间表达或稳定表达，成为基因治疗的一种有效工具。 ⑦基因枪法 基因枪法(又称粒子轰击法) 用高压气体加速把粘有DNA的细微金粉(或钨粉颗粒)打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，完成基因转移的方法 基因枪法适用于动植物组织或细胞、胚胎、细菌及小动物等。用这种方法，已将DNA先后送人酵母的线粒体和核、衣藻的叶绿体和核、洋葱的表皮细胞以及玉米悬浮细胞中。 基因枪法特点：快速、简便、安全、高效。 * * * * 本章重点掌握的内容 概念:受体细胞、电穿孔法、共转化、基因枪法、感受态细胞、转化、转染、磷酸钙-DNA共沉淀法、微注射技术。 选择受体细胞的基本原则 氯化钙转化法的基本原理 脂质体介导法及其转染的机制 常用的基因导入受体细胞的方法。 原核生物细胞作为受体细胞的优点与缺点。 酵母菌作为受体细胞的优点。 哺乳动物细胞作为受体细胞的优点与缺点。 4、接合转化： 接合（Conjugation）：指通过细菌细胞之间的直接接触导致 DNA 从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由结合型质粒完成的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效接触的接合功能以及诱导 DNA分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码 是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式．适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。 非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒（即辅助质粒）非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用 接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒DNA分子也不能直接接进行接合转化。而只能通过其迁移作用来完成。 首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。 整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。 5、重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 转染：将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程，称为转染。 将重组λ噬菌体DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的常规方法是转导操作。 转导(transduction)：指通过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。 具有感染能力的λ噬菌体颗粒除含有λ噬菌体DNA分子外，还包括外被蛋白。 以噬菌体颗粒感染受体细胞，首先必须对重组λ噬菌体DNA分子进行体外包装 。 体外包装，是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组λ噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒的技术。 基本原理：根据λ噬菌体DNA体内包装的途径分别获得缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的λ噬菌体突变株。这两种突变株均不能单独地包装λ噬菌体DNA，但将它们分别感染大肠杆菌，从中提取缺失D蛋白的包装物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。 λ噬菌体DNA体外包装的主要过程 ①制备包装物。 须培养两种溶原菌 诱导溶菌生长 收集和贮存包装物。 ②体外包装。 制备λ噬菌体DNA混合液。 第一次包装。包装物刚融化时，细胞发生破裂，释放出包装物可立即用于包装。 第二次包装。进行第二次包装，可提高包装效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包装反应液的黏度，便于包装反应的进行。 去除细胞屑。第二次包装后，在反应液中加入SM溶液 （噬菌体稀释缓冲液：100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L MgSO4, 50 mmol/L Tris-HCL pH7.5)0.2%