第二章菌种的来源分析.ppt

有机污染物 * 为什么有些突变菌株对末端代谢产物的结构类似物具有抗性?由于选择作用。首先突变是不定向的，是多样化的，这就决定了菌群里什么样的菌型都存在，当然也存在一些具有抗性的菌型，没有抗性的都被杀死，仅有那些具有抗性的突变菌株得以生存。 * * 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。 一、自然选育 自然选育在工业生产上的意义 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验 二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂 物理：紫外，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 { 常用诱变剂及其类别 物理诱变剂 化学诱变剂 生物诱变剂 碱基类似物 与碱基反应的物质 在DNA分子中插入或缺失碱基的物质 紫外线 快中子 X－射线 γ－射线 激光 2－氨基嘌呤 5-溴尿嘧啶 8－氨鸟嘌呤 硫酸二乙酯 甲基硫酸乙酯 亚硝基胍 亚硝酸 氮芥 吖啶类物质 氮芥衍生物（ICR) 噬菌体 （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择 （一）、诱变剂的作用原理 亚硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH 5-溴尿嘧啶 2－氨基嘌呤 （三）、诱变育种的一般步骤 (图) （四）、筛选的方法 随机筛选 形态 理性化筛选 从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。 结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。 HD:高丝氨酸脱氢酶 黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶 AK:天冬氨酸激酶 结构类似物抗性： Lys的类似物AEC(S-(2-氨基乙基)-2′半胱氨酸) Thr的类似物AHV(a-氨基b-羟基戊酸) 营养缺陷型：如Thr缺陷型 三、基因的直接进化(directed evolution) 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传 步骤： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。 主要应用： 酶学性能的提高: pH 温度 有机溶剂 生理环境→工业催化环境 底物专一性 脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯 例： PLA PLA光学拆分选择性(%) 2 31 57 75 81 90 5次错位PCR 2次定点突变 Reetz (1997) Liebeton(2000) 第二章 菌种的来源 定点突变 错位PCR DNA Shuffling:指DNA分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。 X XXX X XX X XX X XXX X XX X X XXX XX X X XX X XXX X X XXX XX X X XX X XXX X XX X XX X XX XXX X X X X X XX X Fragment