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DNA/RNA及蛋白质操作技术 ——DNA基本操作技术 ——RNA基本操作技术 ——蛋白质组学技术 EB（溴化乙锭）染色 银染 脉冲电场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis，PFGE： 分离大于50kb的DNA分子 4）巢式 PCR （ nested PCR ） 巢式PCR，通过两轮PCR反应，使用2套引物扩增特异性的DNA片断。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片断。 巢式PCR除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。 依赖RNA的DNA聚合酶活性； RnaseH 依赖DNA的DNA聚合酶活性 基因克隆 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物 3’端的碱基要求严格配对；5’端无严格 （7）引物中有或能加上合适的酶切位点 （8）引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段 5′CTTCCACGACGCTATC//GAGAGATTCGCCTGCA 3′ 关于PCR引物设计 例题1：根据以下cDNA（互补DNA）编码区片段的两末端已知序列，如何设计下游引物，以扩增该cDNA片段。 例题2: 如何利用网络技术和DNA分析软件设计简并引物, 以PCR扩增某蛋白的cDNA? 演示: (1)登录NCBI等网站,收集有关cDNA序列信息; (2)利用DNA分析软件(如,DNAman等)对所收集的cDNA序列进行比对分析,利用最保守序列设计引物。 Some DNA Polymerases Used in PCR （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 PCR技术的特点 1 ）高度的灵敏性 30轮循环 扩增量达230个拷贝（109拷贝） PCR产物每轮循环增加一倍 2）特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反 应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简单易行 利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出 可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。 电泳分析 PCR设备 PCR检测 核酸的凝胶电泳 原理：利用电泳迁移率差异，对核酸进行定性 和定量分析 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳； 聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 琼脂糖凝胶电泳（Agorose） 低熔点凝胶（Low Metling Agarose） 凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖 50 000~1 000 0.7%琼脂糖 20 000~1 000 1.4%琼脂糖 6 000~300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000~100 10.0%聚丙烯酰胺 50