蛋白质相互作用概要.ppt

从生物学功能的改变到相互作用蛋白质 的发现。 功能性筛选：RNAi，基因敲除小鼠 一些常规生化技术方法：方法和原理 蛋白质等电点计算：对于实验buffer体系pH值有重要作用。 蛋白质浓度的测定：定量分析的基础。 荧光：ECL和细胞免疫荧光。 层析：离子交换、分子筛、亲和层析、反相层析、等。 离心：超速离心。 电泳：SDS、非变性电泳、等点聚焦、等。 Kit方便了我们的实验，但不能方便我们对原理的认识。 谢 谢 Two-Hybrid的优点： 是酵母细胞内的in vivo相互作用。 只需要cDNA，简单。 弱的相互作用也能检测到。 Two-Hybrid的缺点： 都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。 酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。 自身激活报告基因。 都基因库的要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性。 第三者Z插足介导的相互作用。 假阳性。 lacZ UAS DB X lacZ DB X Auto activation BD X Marker1 AD Y lacZ UAS AD Y lacZ AD Y Marker2 Phage display（噬菌体展示） Phage display（噬菌体展示） Phage display的最大优点是数量大 细胞：108~109 细菌：1010 Phage：1012 寻找受体的配体 7肽：8x1016 蛋白质-蛋白质直接相互作用 Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） Affinity interaction（亲和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白质组学技术） SPR is used to monitor interactions occurring in a biospecific surface on a metal layer by measuring changes in the solute concentration at this surface as a result of the interactions. Surface Plasmon Resonance SPR 优点：无标记、实时 Label-free detection SRP does not require any labels or reporter groups to detect biomolecular interactions. It follows every step in a multi-step analysis procedure, in contrast to label-based methods that often only report the final step. Real time measurement The progress of interactions is displayed directly, as a plot of response (which is directly related to concentration changes at the surface) against time. Immediate feedback on the status of an interaction speeds up assay development and analysis. The results can be processed further after the run, for example to extract kinetic constants for the interaction. 蛋白质-蛋白质直接相互作用 Co-immunoprecipitation and antigen-antibody interaction（免疫共沉淀和抗原抗体结合） Affinity interaction（亲和作用） Yeast two-hybrid and phage display（酵母双杂交和噬菌体展示） Surface Plasmon Resonance FRET Proteomic analysis（蛋白质组学技术） Donor Acceptor (2-10nm) Excitation frequency Emission frequency = Excitation frequency Emission freque