高中生物 第五章微生物生长量的测定材 人教版第一册.docVIP

微生物生长量的测定微生物学研究中常常要进行微生物生长量的测定，有多种方法用于微生物生长量的测定，概括起来常用的有以下几种： （一）直接计数法 ( 又称全数法 ) 1 、计数器直接测数法 取定量稀释的单细胞培养物悬液放置在血球计数板 ( 细胞个体形态较大的单细胞微生物，如酵母菌等 ) 或细菌计数板 ( 适用于细胞个体形态较小的细菌 ) 上，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供测样品的细胞数。 （ 1 ）血球计数板及细胞计数 血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四条下凹的槽,构成三个平台.中间的平台较宽,其中间又被一短横槽隔为两半,每半边上面,刻有一个方格网.方格网上刻有9个大方格,其中只有中间的一个大方格为计数室,供微生物计数用.这一大方格的长和宽各为1mm,深度为0.1mm,其体积为0.1mm3. 计数室通常有两种规格.一种是大方格内分为16中格,每一中格又分为25小格;另一种是大方格内分为25中格,每一中格又分为16小格.但是不管计数室是哪一种构造;它们都有一个共同的特点,即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。血球计数板是一种在特定平面上划有格子的特殊载片。在划有格子的区域中，有分别用双线和单线分隔而成的方格。其中有以双线为界划成的方格 25( 或 16) 格，这种以双线为界的格子称为中格（见图 5-10 ），其内有以单线为界的 16 （或 25 ）小格。因此，用于细胞计数的区域的总小格数为： 25×16 = 400 该 400 个小格排成一正方形的大方格，此大方格的每条边的边长为 1 mm ，故 400 个小格的总面积为 1mm 2 。 在进行细胞计数前，先取盖玻片盖于计数方格之上，盖玻片的下平面与刻有方格的血球计数板平面之间留有 0.1mm 高度的空隙。含有细胞的供测样品液被加注在此空隙中。加注在 400 个小格（ 1mm 2 ）之上与盖玻片之间的空隙中的液体总体积应为： 1.0mm×1.0mm×0.1mm = 0.1mm 3 一般表示样品细胞浓度的单位为：亿个 / mL 。因此，在计数后，获得在 400 个小格中的细胞总数，再乘以 10 4 ，以换算成每 mL 所含细胞数。其计算公式如下： 菌液的含菌数 /mL = 每小格平均菌数× 400 × 10 000 ×稀释倍数 在进行具体操作时，一般取五个中格进行计数，取格的方法一般有两种：① 取计数板斜角线相连的 5 个中格；② 取计数板 4 个角上的 4 个中格和计数板正中央的 1 个中格。对横跨位于方格边线上的细胞，在计数时，只计一个方格 4 条边中的 2 条边线上的细胞，而另两条边线上的细胞则不计；取边的原则是每个方格均取上边线与右边线或下边线与左边线。 图 5 — 10 血球计数板方格示意图 （ 2 ）细菌计数板及细胞计数 细菌计数板与血球计数板结构大同小异，只是刻有格子的计数板平面与盖玻片之间的空隙高度仅 0.02mm 。因此，计算方法稍有差异（见以下计算公式），余与血球计数板法同。 菌液样本的含菌数 /mL = 每小格平均菌数× 400 × 50 000 ×稀释倍数 2 、涂片染色计数 用计数板附带的 0.01mL 吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置刻有 1 cm 2 面积的玻片上，使菌液均匀地涂布在 1cm 2 面积上，固定后染色，在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出每 1cm 2 中的菌数，然后按 1cm 2 面积上的菌液量和稀释度，计算每 mL 原液中的含菌数。 原菌液的含菌数 /mL = 视野中的平均菌数× 1cm 2 / 视野面积× 100 ×稀释倍数 3 、比浊法 这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的单细胞微生物，其细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度 ( 或透光度 ) 或浊度可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器。此法比较简便，但使用有局限性。菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他物质，否则不能获得正确结果。一般在用此法测定细胞浓度时，应先用计数法作对应计数，取得经验数据，并制作菌数对 OD 值的标准曲线方便查获菌数值。 （二）活菌计数法 ( 又叫间接计数法 ) 活菌计数法又称间接计数法 。直接计数法测定到的是死、活细胞总数，而间接计数法测得的仅是活菌数。这类方法所得的数值往往比直接计数法测得的数值小。 1 、平板菌落计数 此法是基于每一个分散的活细胞在适宜的培养基中具有生长繁殖并能形成一个菌落的能力；因此，菌落数就是待测样品所含的活菌数。 将单细胞微生物待测液经